神经元形态发生研究方法 离体 胚胎小鼠大脑皮层中的RNAi电穿孔技术

以下实验的总体目标是利用脑片组织培养对大脑皮层发育过程中基因功能进行快速评估。该方法通过将共表达抑制性RNA和GFP标记物的质粒导入小鼠大脑皮层来实现。对脑组织施加短暂的电脉冲，使质粒DNA转染神经前体细胞。

接下来，解剖大脑组织，进行包埋并切片，以制备可用于体外神经元形态发生的器官型脑片。通过直接观察GFP标记的细胞，可在这些器官型脑片中筛选出具有迁移或形态学缺陷的皮层神经元亚群。大家好，欢迎来到今天位于布朗大学分子生物学系的我的实验室，Liza博士以及两位学生Kat Zer和Mark Seba将为大家演示体外电穿孔技术及器官型脑片培养技术，该技术在神经发育研究中具有重要应用价值。

该方法有助于回答神经发育多个方面的关键问题，包括神经发生、神经元迁移和神经元形态发生。由于该分析是在接近体内环境的条件下进行的，因此为研究功能未知基因提供了低成本且快速的替代方案，避免了构建转基因或基因敲除动物模型的需要。此外，与体内电穿孔技术相比，这种活体电穿孔实验的成功不依赖于熟练的手术操作技能，所需培训时间更短，更容易掌握。

处死一只怀孕的雌性小鼠后，将胚胎剥离至冰上预冷的完全 HBSS 溶液中，保持其各自位于胎盘囊内。接着在冷的 HBSS 溶液中，从囊中取出一个胚胎，于第一椎骨后方剪下其头部用于注射，并使用定制的哈密尔顿注射器将头部置于培养皿上方的一张多聚甲醛包埋纸上。通过第三脑室注射 6 至 8 µL 的 DNA 快绿混合液。

随后，混合液将充满皮层囊泡中的两个侧脑室。进行电穿孔时，使用BTX镊子型铂电极。将正极置于将要进行电穿孔的皮层一侧。

例如，电极应置于头部顶端以针对背侧皮层。为了获得较高的转染效率，务必将 DNA 浓度调整为每微升一微克，并使用从大提质粒试剂盒中提取的 DNA。如有必要，可使用无内毒素试剂盒在电穿孔后纯化 DNA。

解剖前将头部置于冰上孵育至少五分钟。进行电穿孔时，使用适量的电脉冲和电流非常重要，以避免损伤较年轻的胚胎脑组织。电穿孔后，组织会变得非常脆弱。

必须非常仔细地进行解剖，因为皮肤和颅骨可能牵拉皮质囊泡的脑膜，从而在将皮质囊泡从颅骨中取出时造成损伤。五分钟后，在冷的 HBSS 中解剖出脑组织，首先在头部侧面做一个小切口，然后将头部两侧的皮肤剥离。

接下来，用精细镊子轻轻剥离脑表面的软脑膜。将完整的大脑从颅骨中取出。操作完成后，将大脑置于冰上预冷的 HBSS 中，并准备进行组织包埋。

开始用3%低熔点琼脂糖填充模具。将模具置于冰上，使琼脂糖在模具底部附近凝固。首先，确保脑组织保持支撑且居中。

现在用精细镊子轻轻从 HBSS 中取出一个脑组织，用擦镜纸或滤纸吸去多余的缓冲液，将脑组织放入低熔点琼脂糖中。然后使用移液枪头在模具内轻轻搅动脑组织，以最大化琼脂糖与组织的接触面积。当所有脑组织转移完毕后，调整每个脑组织在模具中的位置，使其大致保持相同的方位和深度。

琼脂糖凝胶约在5分钟内凝固，因此请迅速操作。将琼脂糖凝胶在冰上再孵育5分钟，使其完全凝固。

在安装模块前修剪多余的包埋剂。然后使用快速粘合的塑料胶水将包埋块相互连接，每块脑组织在堆叠时应使其嗅球朝上。模块粘合后，修剪包埋剂以确保每块脑组织均可被振动切片机切片。

然后立即将其浸入冰冻的HBSS中。切片时，将振动切片机的速度设为低速，约为最大速度的一半，刀片振动频率设为最高档位。随后切出250 µm厚的冠状切片，用弯曲的精细铲匙收集切片，并用细毛刷或镊子将其转移至组织培养板中。

如果组织从琼脂块中脱落，说明在组织培养罩中组织与琼脂块的接触未充分形成。此时，准备六孔板，每孔加入1.8毫升切片培养基，并在每个孔中放置含有层粘连蛋白多聚赖氨酸的组织型插入物。然后向组织型切片插入物顶部加入500微升切片培养基。随后将最多五个切片转移至每个插入物中。

接下来，从切片表面去除多余的培养基，以确保切片尽可能保持其形态结构，并将细胞死亡降至最低。维持一个健康的液-气界面至关重要，切片不应漂浮在培养基中。最后，将切片置于37°C的湿润培养箱中孵育。

每隔一天更换膜下培养基体积的一半。切片不应漂浮在培养基上。转染后八小时即可观察到表达电穿孔载体的神经元，在培养所需天数后，将膜上的切片固定以进行分析。

用预热的PBS清洗每个有机典型插入物五分钟。总共进行三次PBS清洗，然后在4摄氏度下用4%多聚甲醛固定组织一小时。固定后，可使用细胞标记物对组织进行分析，或仅用苏木精染色。一小时后，用1×PBS对切片进行三次、每次十分钟的清洗。

然后在室温下，将切片置于含10%山羊血清的1×XPBS溶液中，轻轻振荡孵育两小时。接着在室温下，用一抗溶液轻轻振荡孵育组织切片一小时进行染色。染色后，在等待过程中用1×XPBS轻轻振荡洗涤三次，每次10分钟，以去除未结合的抗体。

将磨砂玻璃载玻片放入足够深的水槽中，确保组织置于载玻片上后能被液体浸没。为固定切片，首先使用解剖刀将膜切下。

第二，使用精细镊子将最多五片膜结合的切片转移至浸在水中的每张载玻片上。第三，去除每张载玻片上的多余水分。第四，在每片脑切片上滴加一滴封片溶液。

最后，轻轻地将盖玻片盖在切片上，并去除任何气泡。根据电转染的DNA量和胚胎发育阶段，切片即可用于显微镜观察。在电转染过程中，转染效率被发现存在差异。

转染P沉默载体后8小时，GFP载体细胞开始表达GFP。在较长的培养期间，细胞经历正常的神经发生过程，包括增殖、迁移和早期神经元分化。这些脑片在培养基-空气界面维持良好的情况下，形态可保持五天。

从动物安乐死开始，到将脑片放置于膜插件中为止，整个实验过程必须在两小时内完成，以最大限度减少该操作后细胞的死亡。此外，可通过向器官型脑片中添加外源因子，来探究不同生长因子或药理学试剂在各种神经发育机制中的作用等问题。