利用可视化与遗传学操作技术研究小鼠大脑皮层和海马中的树突及树突棘 在子宫内 电穿孔

本实验的目的是利用子宫内电穿孔技术，在小鼠大脑皮层和海马中实现树突和树突棘的可视化以及基因操作。该方法首先将所需的质粒DNA溶液注射到子宫内胚胎的侧脑室中，随后通过调整Palo电极的不同位置来完成电穿孔过程。

根据DNA注射，对大脑皮层或海马体进行电穿孔，随后在所需的小鼠出生后或成年阶段进行操作。小鼠经灌注后取脑，最后使用振动切片机对脑组织进行切片。

最终，可以使用共聚焦显微镜观察树突和树突棘。与研究树突和树突棘的其他方法相比，单细胞电穿孔技术具有多项优势。实际上，该技术首先能够直接在活体中研究这一方面。

此外，与制备基因敲除小鼠相比，显微注射电转技术是一种快速研究基因抑制或基因表达效应的方法，可用于研究树突和树突棘的发育，不仅限于特定的细胞结构，还可针对发育的特定阶段。利用可诱导系统进行显微注射电转也是识别参与树突和树突棘发育相关基因之间功能相互作用的有效工具。事实上，与病毒等方法相比，我们能够更灵活地在同一细胞群体中同时引入多个shRNA或多个目的基因。首先，将DNA用纯水稀释至所需浓度，并加入快绿染料至终浓度为0.05%。使用微量玻璃针拉制仪制备用于注射的玻璃针。

将一只怀孕的小鼠放入异氟烷麻醉诱导室中，并将氧气流速调至每分钟两升。当动物失去翻正反射时，将其转移至术前麻醉面罩。在每只眼睛上滴一滴眼用凝胶，并使用电动剃须刀剃除腹部的毛发。

用氯己定擦拭剃毛区域一次，以收集飘落的毛发。将动物转移至手术区域的第二个麻醉罩中，使其背部朝向加热垫。当角膜反射消失时，开始手术。

戴上口罩和无菌手套，并用无菌手术单覆盖动物。使用氯己定对剃毛区域至少清洁三次。使用手术刀沿中线垂直切开皮肤。

使用剪刀，沿线性肘部在腹部肌肉上做类似的切口。选择最容易获取的胚胎。

将环形镊置于两个胚胎之间，小心地将胚胎链从腹腔中拉出。此后，始终使用无菌预热的 PBS 保持胚胎湿润。使用环形镊。

轻柔地调整胚胎在羊膜囊内的位置，并用环状物固定头部。轻轻挤压，使胚胎向上靠近子宫壁。另一只手握住毛细管固定器，小心地将针头插入半球中部，以对准侧脑室。

注意尽量减少针头在子宫壁表面的移动，并避免刺破血管，踩下脚踏板注入约 0.5 µL 绿色 DNA 溶液。将电极置于胚胎头部两侧，若进行皮层电穿孔，则正极电极置于注射侧脑室同侧；若进行海马电穿孔，则置于注射侧脑室对侧。随后施加 5 次 30 伏、50 毫秒持续时间的电脉冲，间隔 1 秒。

避免电流通过胎盘，否则将导致胚胎死亡。为提高存活率，应在30分钟内完成所有胚胎的注射和电转操作。操作完成后，用PBS冲洗腹腔，并使用环形镊子将子宫角复位至原始位置。使用薇乔可吸收缝线缝合腹壁和皮肤。将动物置于恢复室中，直至其苏醒。

术后24小时和48小时，将小鼠转移至带有加热垫的笼子中。观察小鼠行为以评估疼痛、痛苦或应激情况，并称量动物体重以分析脑组织。在出生后阶段，使用振动切片机对先前灌流并后固定的脑组织进行切片，将切片置于Aqua Poly/Mount中封片，用于成像观察树突和树突棘。

该图显示了在胚胎14.5天（E14.5）对小鼠进行电穿孔后，大脑皮层、海马CA1区和齿状回中电穿孔细胞的示例，绿色荧光蛋白（GFP）载体在出生后第14天收获脑组织时表达。通过注射少量DNA溶液，可标记少数细胞，从而能够在较高放大倍数下观察孤立的GFP阳性细胞的树突分支结构及其树突棘。在进行该操作时，需注意注射少量DNA溶液，以仅靶向少数细胞，并能够观察和量化树突棘或电穿孔神经元的形态。