通过¹H 核磁共振波谱法评估无菌小鼠在逐步定植过程中的肝脏代谢变化

本实验的目的是评估逐步定植对宿主肝脏代谢的影响。首先对无菌小鼠进行逐步定植以实现该目标，通过核磁共振（NMR）波谱法检测尿液中微生物共代谢物的排泄情况，从而监测定植过程。

在监测定植过程后，从小鼠体内采集肝脏活检样本，并进行代谢谱分析的制备。随后，可利用非破坏性的高分辨率魔角旋转核磁共振波谱法对完整的活检样本进行检测，获得肝脏代谢谱。最终，这种质子核磁共振波谱技术可揭示参与能量代谢和氧化应激等代谢通路中的多种代谢物。

因此，该实验可为肝脏在定植过程中的功能提供见解，也可应用于肾脏等其他系统。为实现动物定植，需将无菌小鼠从隔离器中取出，并饲养于常规饲养室的笼具中，笼具前方需配备过滤装置，常规饲养的动物作为对照组。

然后，取自对照常规鼠笼中三天大的垫料的一半与无菌动物的垫料混合。通过将小鼠置于1.5毫升微量离心管上方并轻轻按摩其肠道以辅助排尿，收集尿液。使用5毫米核磁共振（NMR）探头检测至少需要20微升尿液，但建议使用30微升以提高代谢谱分析的质量。收集后应立即用液氮速冻尿液，并在至少-40摄氏度条件下保存，直至进行NMR分析。

在进行核磁共振（NMR）检测之前，用重水配制0.2摩尔的磷酸钠缓冲液，pH值为7.4，并含有1毫摩尔的TSP。取30微升待测尿液与30微升磷酸钠缓冲液混合。使用配备金属针头的50微升玻璃注射器，将50微升混合溶液转移至1.7毫米的NMR毛细管中。

注意避免产生气泡。将毛细管适配器安装在装有尿液样本的毛细管顶端，并将其放入一根2.5毫米的NMR微量管中，以用于5毫米NMR探头。这种组合的试管可作为标准的5毫米NMR试管用于谱图采集。

本实验中，使用一台Bruer Advanced 700兆赫兹核磁共振波谱仪（NMR）采集数据。根据书面实验方案中讨论的参数，获取一维质子核磁共振谱。核磁共振数据采集完成后，按照书面实验方案中所述的动物安乐死步骤，在2.5毫米核磁共振管中使用提取杆轻轻旋转毛细管接头，将毛细管取出。

准备进行肝活检。请勿使用任何含酒精的产品，以避免污染，并使用水或生理盐水清洗工具。为获得可重复的活检样本，应从左叶采集肝活检组织。

采集时应始终位于左叶的中央区域，避免在组织较薄的周边区域操作。注意勿穿破胆囊，以防胆汁泄漏。组织采集后应立即用水或生理盐水冲洗。

立即将活检组织在液氮中速冻，并在负80摄氏度下保存，直至进行核磁共振分析。为进行高分辨魔角旋转核磁共振（H-R-M-A-S-N-M-R）实验，将第三份活检组织插入氧化锆转子中，并用纯重水填充剩余体积以实现核磁共振信号锁定。注意避免产生气泡，因为气泡可能影响后续匀场和数据采集的质量。使用圆柱形螺丝插入一个50微升的聚四氟乙烯（Teflon）垫片。

将其拧下，并使用短端的深度规进行校准。将螺纹销置于垫片上，用螺丝刀轻轻拧紧。用一张纸巾擦干仪器表面及残留的水分。

接下来，将盖帽置于转子顶部，并将其插入转子压紧器中。用力按压，直至盖帽完全就位。转子与其盖帽之间不应留有任何空隙。使用黑色记号笔标记转子底部的一半位置，以便进行光学转速检测。

转子充分装填后，将其放入核磁共振波谱仪中，并以5 kHz开始旋转。此处使用的是Bruker Avance III 500 MHz波谱仪。采用CPMG脉冲序列采集质子核磁共振谱。

根据制造商的说明，可利用在 5.22 百万分之一处出现的强α和数字葡萄糖双重峰对所得核磁共振（NMR）谱图进行校准。拆卸转子时，先使用帽盖移除工具取下帽盖，拧下螺纹销，移除聚四氟乙烯（Teflon）垫片。使用圆柱形螺丝，可用水和洗涤剂彻底清洗装置。

在定植过程期间，肠道微生物共代谢物的出现情况在此动物定植20天后的尿液代谢谱质子谱中得到清晰展示。该动物在无菌状态下未排泄任何吲哚硫酸，且仅排出极少量的苯乙酰甘氨酸（缩写为PAG）和对羟基苯乙酰硫酸。随着定植的进行，这三种由肠道微生物介导的蛋白质代谢标志物显著增加，并在第20天达到平衡状态。

通过积分特定的 PAG 三重峰，可以量化该特定标志物随时间的增加情况。该图展示了利用质子 H-R-M-A-S-N-M-R 波谱法对七只动物在定植期间平均 PAG 浓度的检测结果，同时获得了两只小鼠在定植前后肝脏代谢谱。此图很好地说明了从 A-M-A-S-N-M-R 基础的代谢谱中可获得的信息。

可以检测到多种氨基酸以及能量代谢产生的代谢物。这些谱图还包含与氧化应激、核苷酸代谢和甲胺代谢相关的信息。在此示例中，无菌小鼠几乎检测不到糖原，且葡萄糖和甘油三酯含量极低，这一现象非常明显。

因此，通过遵循此操作流程，可应用多种统计工具（如chemo）根据代谢谱对逻辑样本进行聚类，并突出与代谢状态相关的生物标志物。