鼻腔定植Streptococcus pneumoniae期间炎症反应的表征

该实验步骤包括用肺炎链球菌定植小鼠鼻咽部，随后提取定植的细菌以及黏附或募集的细胞。首先需制备所关注肺炎链球菌（S. pneumoniae）菌株的细菌接种液。

将活细菌经鼻内接种至处于固定装置中的麻醉小鼠体内。在达到预期的定植时间后，处死小鼠，并通过插管暴露的气管，冲洗内容物至鼻腔，进行鼻腔灌洗。鼻腔灌洗液中的细菌数量可采用微生物学技术进行定量。 Alternatively，可采用流式细胞术对募集的免疫细胞进行表型分析，或采用定量PCR技术检测免疫应答。

在开始实验之前，为了测量目标 mRNA 的表达水平，你需要为经鼻定植步骤准备小鼠固定器，并为鼻腔灌洗准备带套管的针头。小鼠固定器可通过简单地剪去 50 毫升 Falcon 管的锥形尖端来制备。创建开口后，务必使用剪刀将任何锋利的边缘修平。

制备套管针时，您需要以下物品：内径为0.38毫米的PE 20聚乙烯管。一支1毫升注射器配有26号和3/8英寸斜面针头，一把锋利的精细虹膜剪刀，以及一对镊子。使用精细剪刀将PE 20管剪成约2.5厘米或1英寸长的小段，确保每段两端均具有斜面尖端。

用镊子小心地将其中一块滑至针尖上。避免刺穿导管侧壁，套管针可保存在70%乙醇中直至使用，并在使用前直接用PBS冲洗。对于通过鼻内接种肺炎链球菌（S. pneumoniae）定植小鼠，我们建议使用每10微升含10⁹个菌落形成单位的菌液。

对于最终剂量为10的7次方CFU的情况，将接种物置于冰上直至使用前，并确保在每次定植之间进行振荡混匀。除接种物外，您还需要P10或P20移液器、灭菌的移液器吸头以及小鼠固定器。通过尾巴分离单只小鼠，并将其放入预先准备好的小鼠固定装置中进行固定。

如果难以将小鼠放入固定器中，可尝试将固定器置于小鼠前方并略高于其位置，使动物能够向上爬入。一旦小鼠进入固定器，用手轻轻从其身体基部向上推，使其鼻部从固定器的锥形末端伸出，从而固定小鼠。使用 P 10 或 P 20 移液器，将 10 微升制备好的菌液接种到每只小鼠中，均匀分配至两侧鼻孔。

通过逐步脉冲式接种，使接种物滴入小鼠鼻腔，并留出足够时间让小鼠吸入接种物。小鼠可能会将部分接种物通过打喷嚏排出鼻腔，此现象属正常。需要注意，小鼠在该操作过程中应处于麻醉状态，以确保细菌局限于鼻咽部，而不会扩散至下呼吸道。

本演示中，我们使用 PBS 进行接种；但在处理活细菌时，务必根据机构批准的指南进行操作。例如，大多数机构要求在生物安全二级柜中进行定植操作。如果在终点监测中使用体重指标，在定植后立即开始，应每 12 至 24 小时监测一次小鼠的临床症状，包括嗜睡、毛发竖立和体重减轻。

小鼠定植后，应根据实验需求维持相应时间。在此期间结束后，需对小鼠实施安乐死，并进行鼻腔灌洗，因为颈椎脱位法可能损伤气管，因此必须避免使用此种安乐死方法。

进行鼻腔灌洗前，请确保已准备好以下物品：预先制备好的带套管针头、70%水性乙醇、一把镊子、一把锋利的精细虹膜剪、磷酸盐缓冲盐水、RNA裂解缓冲液以及若干1 mL离心管。准备就绪后，将动物仰卧平放，使用70%水性乙醇对其体表毛发进行消毒，特别是颈部区域。

注意防止乙醇进入鼻孔。沿动物颈部中线做一条单一的纵切口，以便形成开口以观察气管。小心将皮肤向两侧剥离，暴露下方的颈部组织。

此时，应可见气管两侧被纵行肌肉环绕。需小心剪开这些肌肉，以清晰暴露气管本身，注意避免切断周围的血管组织。若不慎切断血管导致该区域出现血液，应在继续操作前妥善处理。

等待出血停止，然后通过滴加无菌 PBS 并使用无菌纱布轻轻吸去多余水分，反复清洗该区域数次。待气管充分暴露后，在气管约中段位置做一横向的新月形切口。将无菌 PBS 滴入已插管的注射器中。

将套管向鼻部方向插入气管，插入时保持斜面边缘朝下，以便于操作。套管到位后，旋转180度，轻轻向上探入，直至感到轻微阻力。将指定用于样本采集的EEND DPH管置于小鼠鼻部下方。

通过滴加少量 PBS 灌洗液来测试导管位置是否正确。若导管放置到位，小鼠鼻咽部周围应形成一滴液体。如果测试用的 PBS 直接从小鼠口腔流出，则需将导管稍许回撤，并轻轻向前探查，直至感到轻微阻力，再次调整其位置。

注意不要在此阻力之后继续过度推进套管，否则会使其越过鼻腭进入口腔。确认套管位置正确后，迅速注入 200 µL PBS，以帮助移位并收集尽可能多的细胞。液体应从小鼠的鼻孔流出，进入收集管中。

立即将样本置于冰上。这些样本可随后用于检测细菌载量以及细胞募集情况。若需收集用于RNA分析的样本，应使用另一支含有500 µL RNA裂解缓冲液的套管针进行二次鼻腔灌洗。

请注意，RNA裂解缓冲液会剥离上皮组织并破坏周围组织，因此必须小心避免与肺等器官接触。如果需要保留这些组织以定量鼻咽部细菌载量，则需要以下材料。

加入5%羊血的含三磷酸胰蛋白胨大豆卵的微生物培养板，以及Epicor管。涡旋混合器、PBS无菌移液吸头，以及P20和P200移液器。首先在生物安全二级（BSL-2）操作台内，为每份鼻腔灌洗样本制备一系列梯度稀释液。

通常，鼻咽部肺炎链球菌（S. pneumoniae）的浓度预计在零至10⁴ CFU之间。因此，需进行三次十倍梯度稀释：取10微升未经稀释的鼻腔灌洗样本加入第一支试管中，使其浓度为10⁻¹ CFU/mL，随后依次向下稀释，共稀释三个样本，每次稀释之间需充分涡旋混匀。请注意，本视频仅用于示范目的。

正确的实验操作技术，包括在不同稀释液之间更换移液器吸头，必须始终严格遵守。使用记号笔将平板背面均分为四个象限，并标记每个象限对应的稀释度。在琼脂平板上，每个稀释度点样三滴，每滴10 µL。将平板敞口放置15至30分钟使其干燥，然后盖上皿盖，倒置放入细菌培养箱中，在适合肺炎链球菌生长的最佳条件下培养，通常为37°C和5% CO2。

将这些平板培养 24 至 48 小时。培养结束后取出平板，通过计算平板上形成的菌落数量并取平均值，确定定植细菌的数量。对于每个稀释度，可通过其特有的米色外观以及α溶血环来鉴定氨基菌菌落，该溶血环为菌落周围由细菌消化琼脂中血液补充成分所形成的微小晕圈。

最后，通过观察每个菌落中心出现的小型凹陷，使其呈现出类似红细胞的形态。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在小鼠体内建立鼻咽部定植模型，如何在定植后通过鼻腔灌洗法从小鼠鼻咽部分离细菌和细胞，以及如何利用微生物学技术对相应的细菌载量进行定量分析。我们希望本视频所介绍的方法能够推动您采用经鼻定植模型，进一步研究宿主对病原体的免疫应答，尤其是在这一尚未被充分研究的区域中开展相关探索。