利用SecM阻滞序列作为分离核糖体结合多肽的工具

本实验的总体目标是从体外无细胞系统翻译过程中分离出与SEC TED 70S核糖体结合的新生肽链复合物（RNCs）。首先，将一段17个氨基酸长的SEC M阻滞序列引入目的基因的C末端，并将其克隆至T7转录启动子的下游。接着，通过体外转录反应转录mRNA，然后进行纯化。

然后，将纯化的mRNA在含有放射性氨基酸的S30大肠杆菌提取物系统中进行翻译，以标记合成的蛋白质或新生多肽链。最后，通过蔗糖梯度离心和分级收集，分离第二次形成的Mr.Ed核糖体结合的新生链复合物。最终，通过对梯度组分中分离出的标记多肽进行凝胶电泳分析，可以获得结果显示新生链稳定地结合在70S核糖体上。

与现有方法（如使用缺乏终止密码子的 mRNA）相比，该技术的主要优势在于，它能够以高效率确保在翻译过程中新生多肽链与 70 S 核糖体的结合，并在后续的离心步骤中保持这种结合。此外，与无终止密码子技术不同，该方法在体外和体内系统中均能以几乎相同的效率应用。该方法有助于回答翻译过程中蛋白质折叠领域的关键科学问题，例如在翻译早期阶段各种翻译折叠中间体可能如何形成，并进一步帮助利用直接或间接结构分析手段解析其结构。

探针与检测方法：该技术可帮助我们解析核糖体上蛋白质折叠的途径。在本方案中，我们描述了分离与70S核糖体结合的全长双γB晶状体蛋白新生链的方法。但该技术也可用于分离几乎所有目标蛋白的核糖体结合新生链。

该策略也可用于分离皮肤中截短的天然多肽链。通常，初次使用此方法的研究人员可能在蔗糖梯度离心步骤中遇到困难。然而，对于有经验的操作者而言，这不应成为问题。我们决定采用第二段阻滞序列，以分离与70S核糖体结合的γB-晶状体蛋白新生多肽链，此决定源于最初使用缺乏终止密码子的mRNA所进行的若干次不太成功的尝试。

后一种技术在后续离心步骤中无法像使用SECM阻断序列的技术那样高效地确保RNCs的稳定性。该方法的可视化演示至关重要，因为梯度制备和RNC分离步骤可能较难掌握，且需要具备一定技术水平才能获得可重复的结果。演示操作的人员将由我实验室的一名研究生完成。进行体外转录和翻译时，首先选择一个已克隆至T7和/或SP6启动子载体中的目的基因，以生成核糖体新生肽链复合物（ribosome nascent chain complexes, RNCs）。

通过添加来自 M 的阻滞诱导序列，延长目标多肽的 C 末端，以确保该多肽片段能够从核糖体通道中伸出。在蛋白与 SEC M 阻滞序列之间添加一段富含甘氨酸和丝氨酸的柔性连接子，用于制备体外转录模板。使用限制性内切酶切割开放阅读框下游序列，使模板 DNA 线性化，然后进行 AROS 凝胶电泳，以验证样品是否完全消化。在确认最佳 DNA 浓度后，按照制造商说明书使用高效转录试剂盒合成信使 RNA。

使用氯化锂沉淀法纯化 mRNA。然后在丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上跑样以验证其纯度，用于体外翻译。

在无核酸酶的水中使用大肠杆菌系统，加入1毫摩尔的氨基酸混合物（不含甲硫氨酸）、10单位的核糖核酸酶抑制剂、20微居里的³⁵S-甲硫氨酸、20微升反应混合液、24微升重建缓冲液和24微升大肠杆菌裂解物。将反应体系在30摄氏度预孵育5分钟。然后加入1至2微克的mRNA，并在30摄氏度继续孵育10至15分钟。

通过将反应物置于冰上停止反应，以分离70S核糖体结合的新生肽链复合物或ncs。将翻译反应液加在4.5毫升5%至30%蔗糖梯度溶液上方，蔗糖梯度溶液含20毫摩尔HEPES氢氧化钾（pH 7.5）、15毫摩尔氯化镁、100毫摩尔醋酸钾和1毫摩尔DTT，在4°C下以41,000转/分钟离心2小时。离心后，使用可编程密度梯度系统和设定在254纳米波长的吸光度检测器对蔗糖梯度进行分级收集。

收集含有70S核糖体的组分，用于进一步分析，以确定SEC M延伸蛋白是否仍与70S核糖体结合。通过加入三氯乙酸沉淀每个梯度组分中的蛋白质。将样品在4°C下孵育过夜，次日以14,000 × g离心15分钟以沉淀蛋白质，然后用丙酮与1 mmol/L Tris-HCl（pH 7.6）按4:1比例配制的溶液洗涤沉淀。

将沉淀空气干燥，然后用SDS-PAGE上样缓冲液重悬。通过Tris-Tricine SDS-PAGE分离样品，随后固定并干燥凝胶，进行放射自显影和磷酸化成像，如下图所示。体外翻译后，通过蔗糖梯度离心及组分分离纯化70S核糖体，以确保γB-晶状体蛋白稳定结合于核糖体上。

将含有70S的组分收集后进行脱盐缓冲液置换，并进行第二轮蔗糖梯度离心。此处展示的结果表明，SEC M可有效诱导γB-晶状体蛋白核糖体新生肽链复合物（RNCs）的翻译停滞。掌握该技术后，除新生肽链的凝胶电泳分析通常需要过夜三氯乙酸（TCA）沉淀步骤外，其余操作可在一个工作日内完成。

在进行该实验操作时，显然必须在所有步骤中避免RNA污染。RNA污染可能影响提取物的翻译效率，并导致新生多肽从第70个核糖体上释放。通过本方案，可根据最终研究目标获得NAST以及稳定结合在第70个核糖体上的预定长度的多肽。

这些复合物可用于多种用途，例如通过核磁共振（NMR）或荧光共振能量转移（FRET）等直接或间接方法，确定核糖体结合新生肽链的构象，或在该技术建立后检测因子和配体的结合。该技术为结构生物学和蛋白质折叠领域的研究人员探索全长蛋白质在核糖体上的构象以及共翻译折叠中间体提供了途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备和分离稳定结合于70S核糖体的新生多肽链，这些样品可进一步用于解答翻译过程中蛋白质折叠领域的各种科学问题。

请注意，使用放射性同位素和标记的氨基酸（例如 A 35 蛋氨酸）时需要采取特殊预防措施，在进行本实验操作时应始终予以充分考虑。