将基因转移至发育中的小鼠内耳 在体 内 电穿孔

Jane 转入俄勒冈健康与科学大学俄勒冈听力研究中心 Ling Wang、Han Jang 和 John Burgandy 的活体电穿孔小鼠内耳发育研究。好的，我叫 John Burgandy，我的实验室位于俄勒冈健康与科学大学的俄勒冈听力研究中心。

我叫Ang。我是约翰实验室的海报展示者。我也是约翰实验室的研究助理Ang。

我们的演示分为四个部分。第一部分是腹部正中剖腹术。我们将展示使用戊巴比妥钠进行麻醉的方法、如何评估麻醉效果是否充分、角膜保护措施、手术区域的准备工作、小鼠存活手术数据表的填写、手术室操作流程，包括沿腹中线切开皮肤和腹壁，以及将子宫角向外牵出。

第二部分为经子宫显微注射。我们展示了在胚胎发育第11.5天和第12.5天，对胚胎进行透射照明、胚胎重定向、显微注射、移液器制备，以及向Otis结构中进行显微注射的操作。第三部分为体内电穿孔。

我们演示了桨状电极的放置方法，以及胚胎第11.5天小鼠耳蜗的电穿孔操作。第四部分为典型实验结果。我们展示了绿色荧光蛋白（GFP）在晚期胚胎及出生后早期耳蜗中的表达情况。

这是在胚胎第11.5天对Otis进行表达质粒体内电穿孔后，通过腹侧剖腹术第一部分实现的。固定母鼠时，需牢固抓握其颈部后方的皮肤、尾巴和左后肢。用70%乙醇擦拭腹部后，进行腹腔注射戊巴比妥钠麻醉剂。

将小鼠放回其饲养笼中4到5分钟，以使麻醉剂发挥作用。通过夹捏足部和尾部来评估麻醉是否充分。该母鼠在尾部受到夹捏时仍有缩动反应，因此需要再等待两分钟，直至对有害刺激无反应。

将无菌眼膏涂抹于眼睛，以保护角膜免受干燥损伤。我们在化学通风橱内准备手术区域，以尽量减少毛发和皮屑的扩散。使用精细刀片剃除毛发，暴露覆盖腹壁的皮肤。

彻底去除毛发有助于术后切口的愈合。通过交替使用70%乙醇、碘伏和70%乙醇擦拭腹部皮肤以达到消毒目的。擦拭时应始终从头端向尾端进行，并使用新的外科棉球或棉签。

每次擦拭后，我们都会评估消毒过程中呼吸的深度和质量，以确保小鼠无反应。在第二次使用70%乙醇擦拭后，立即将小鼠腹部朝下置于无菌手术巾上，并放置在加热垫上加热两到三分钟以保持体温。此时可方便地记录小鼠存活手术记录表上的术前数据。我们已将小鼠存活手术数据表作为补充信息附上。

建议包含数据表和动物护理方案，以便机构动物护理与使用委员会能够了解您将如何监测术前、术中和术后的数据。我们为每位手术对象填写一份记录表。我们倾向于在无菌环境中进行手术，尽管对于啮齿类动物通常并无此要求。

工作台面与鼓风机电机及静压箱外壳是分离的，因此不会将振动传递给使用者。在显微注射过程中，我们已在补充信息中附上了对层流罩所做改造的示意图，以方便进行子宫内基因转移操作；主要改造包括降低工作台面高度、设置轨道照明开孔，以及隐藏式仪器电源插座和附属电路的布线通道。手术单元包括电动乳酸林格液输液袋、温浴装置、XY轴和Z轴操作器、立体荧光解剖显微镜、光纤光源及外科手术器械。

脚踏板用于触发显微注射仪和电穿孔仪的聚焦功能。手术显微镜器械需在高压灭菌器中进行灭菌。在不同小鼠之间使用时，器械必须通过玻璃珠灭菌器重新灭菌，或对持针器针头重新进行高压灭菌。

球头剪、持针钳和血管钳是必需的工具。沿腹中线做正中切口，用血管钳夹住皮肤，用球头剪切除皮肤组织，将切口延长至10到14毫米。辨认出腹部腹中线处一条白色的无血管结缔组织带，即腹白线，用球头剪切开腹白线。

注意避免划伤肠道或腹股沟脂肪垫。立即用无菌预温的乳酸林格液冲洗腹腔。检查皮肤和腹壁的切口部位是否有出血。

若存在轻微出血，可用钝头镊子施加直接压力以止血，并用环状尖端镊子将左右两侧子宫角外翻。用镊子的一个环状端轻轻夹住右侧子宫角，并将子宫向中线切口方向牵拉。用另一只手轻轻移动母鼠侧壁，以利于钩住子宫。

从未使用镊子压迫子宫并将其拉出，因为这可能会损伤子宫血管或胚胎。对左侧子宫角重复进行外置操作。立即用预热的乳酸林格液轻轻冲洗新外置的子宫角，并在脂肪垫或肠管随子宫一同外置时，轻柔地将其重新还纳。

这种情况并不常见。第二部分为子宫微注射。将母鼠置于长工作距离物镜下方，并将柔软的光纤电缆光源紧贴子宫壁放置。

用空闲手的手指轻轻按压子宫，以方便识别胚胎的方向。光纤光源的亮度应调至能够准确判断胚胎方向所需的最低强度。

强光可能会将热量传递到子宫，从而引起并发症。我们用一只手握住光纤光源和子宫，用另一只手的指尖通过轻柔触诊来调整胚胎的位置。接下来，我们通过显微镜下的三段视频展示EC剪辑以及在子宫中观察到的常见胚胎方位。

观察者将看到我们在透射照明过程中所观察到的显微图像，尽管是黑白图像，但子宫的透射照明仍可实现对胚胎在体方位的检测。在此示例中，胚胎呈倒立姿势，其腹侧面向观察者。通过前后翻转子宫，我们可以辨识出右侧和左侧后肢、尾部以及左侧眼节头部。

在此示例中，胚胎再次处于倒立位置，但相对于前后轴旋转了约90度。通过轻轻来回摆动子宫，我们可以看到定义左侧后肢和左侧前肢的桨状结构。后脑也清晰可见。

胚胎呈直立位置，其左侧朝向观察者。正在形成的第四脑室在后脑部呈现为一个明亮的区域，清晰可辨。左侧头部的眼部、左前肢和左后肢也清晰可见。

轻柔按压子宫可使胚胎略微调整方向，从而便于识别初级头静脉的主干及其前支和后支，其中前支和后支分别用白色和黑色星号标记。如我们将看到的，Otis 位于初级头静脉前支与后支之间的中点位置。通过透射 illumination 无法经子宫直接观察到 Otis 本身。

我们在两个连续的视频显微镜片段中演示如何将胚胎重新定向，以便将其注入 Otis assist。目标是识别胚胎中的解剖标志，从而推断 otis 在头部侧面的位置。Mesen con，我们的目标是将胚胎从背侧位置重新定向至侧位，以便识别头部的主要静脉。

在背侧位置，中脑、第四脑室和左侧肢体清晰可见。轻柔按压子宫可使胚胎的方位从背侧转向侧方。左眼、头颅、中脑和第四脑室均清晰可辨。

初级头部静脉及其由星号标示的后支也清晰可见。初级头部静脉的前支则未能明确检测到。我们的目标再次是调整胚胎的方向，以便能够识别初级头部静脉，但需在适用于子宫内微注射的较高放大倍数下进行。

从该侧视图可见子宫血管的蜕膜带和左眼。轻柔按压子宫可使胚胎位置发生移动，从而观察到第四脑室和左眼。初级头静脉及其后支（由星号标记），初级头静脉及其分支形成类似美式足球门柱的形态。

耳泡无法透过子宫观察到，但它位于直立结构的中央。Lynn 已经开始对一个胚胎进行注射操作。她透射照明子宫，重新调整胚胎位置以进行显微注射，并将装有快绿染料的显微注射移液管移入视野中。

显微注射移液器连接至移液器固定装置，该装置由X、Y、Z三维显微操作器固定。显微操作器的磁性支架固定在带有聚四氟乙烯底座的钢板上，可轻松实现显微注射移液器的粗调定位。通过显微操作器上的前向微调旋钮适当地推进针头。

制备的移液针对于对小鼠早期耳泡期胚胎进行无创性显微注射至关重要。我们使用水平拉针仪将厚壁的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成移液针。如图A所示，将所得移液针在镊子作用下于约14至16微米外径位置（如图B中箭头所示）手动折断。如图C所示，移液针的断裂处粗糙，呈锯齿状且易碎。

我们将移液管尖端倾斜约20度以使其更尖锐，如图D所示，拉制和倾斜显微注射移液管的相关参数在随文文本中提供。接下来的两个视频显微镜片段展示了在胚胎发育第11.5天和第12.5天对小鼠耳囊进行的显微注射。我们的目标是演示在胚胎发育第11.5天对小鼠耳囊进行的子宫内显微注射。

首先，我们在不包含子宫的情况下进行卵黄囊注射，以明确展示正确靶向注射的表现形式。随后，我们演示真实的经子宫显微注射。在第一次注射中，子宫被纵向切开，使内脏囊突出，覆盖在内脏卵黄囊上的蜕膜带被移除。

胎盘仍附着在子宫上，胚胎存活。局部切除子宫后，可见第四脑室、主头静脉及其前支和后支、移液管，以及以白色显示的囊肿大致位置。在此注射序列开始时，可在脏层卵黄囊血管中检测到血流。

将移液器穿过内脏卵黄囊，将示踪剂注入内淋巴管背侧的osis区域以及直立结构中心的耳囊位置。耳囊位于头部初级静脉前支与后支之间的中点处。在胚胎发育第11.5天的小鼠中进行子宫内微量注射时，需要识别头部初级静脉及其至少一个分支，以估算耳囊辅助结构的位置。

在此示意图例中，初级头静脉的前支和后支均被检测到，其中OUC区域以白色标示。在更接近实际的胚胎呈现中，仅检测到初级头静脉的主干及其一条分支；图中所示实例仅可见初级头静脉的后支，但这已足以判断耳囊（otics）的位置。随后将PT导管经子宫推进，并将染料注入耳囊中。

我们等待30秒，使染料从羊膜腔中清除，此时可背侧观察到内淋巴管和前庭结构。最后，我们展示注射后胚胎的低倍视野，以提供解剖学背景；在此视野中，可见第四脑室、左眼及子宫血管系统。本实验演示了在胚胎发育第12天小鼠耳囊进行的透膜微注射，以及对后脑初形成的第四脑室进行的微注射操作。

透射照明使我们能够在左侧位视图中识别出主要的头部静脉以及眼睛。将移液管经子宫推进至听囊，并注入染料以充盈其腔隙。为了注射第四脑室，我们将胚胎旋转90度，以获得后脑的背侧视图。

注射后的左侧囊肿现位于左侧。将移液管经子宫推进，注入混有fast green的lor。将偶联葡聚糖注入第四脑室。

请注意，染料的注射体积不会进入体内中脑。注射后通过荧光评估确认葡聚糖在第四脑室的定位。随后将胚胎从背侧位重新调整为侧位。

在此侧视图中，内淋巴管位于第四脑室的腹侧。体内荧光验证了右旋糖酐在第四脑室中的定位。出生时，我们使用落射荧光法对幼鼠进行筛选，检测其第四脑室是否存在绿色荧光。

在解剖显微镜下，后脑呈现绿色荧光的幼鼠其内耳在胚胎发育第三阶段经历了体内电穿孔操作。在将表达质粒注入囊腔后，用预热的乳酸林格液对子宫进行新鲜灌注。透射照明有助于将ODU囊置于电极场的中心位置。

光纤光源的金属头从子宫表面撤回。在启动方波脉冲序列之前，我们将在下一个视频显微镜片段中展示体内完整的电穿孔循环。对胚胎第11.5天的小鼠耳囊进行电穿孔时，需要将桨状电极轻柔地放置在子宫上。

在此示例中，左侧耳囊已注入表达质粒，子宫已用乳酸林格液新鲜灌注。在电泳序列开始时，阴极位于充满液体的耳囊外侧，阳极位于内侧，耳囊位于电穿孔电极板的中心位置。轻轻压迫子宫，并通过脚踏开关启动方波脉冲序列。

理想情况下，每次脉冲应输送60至100毫安的电流。随后松开子宫并立即进行灌注。使用环形镊子轻轻施压，将 freshly 灌注的子宫放回腹腔。

子宫复位后，用约4毫升乳酸林格液冲洗腹腔，并在腹腔内留约1毫升乳酸林格液，以帮助维持母体的水分，因为母体在腹部手术后会比平时饮水减少。随后使用持针器以可吸收缝线缝合腹壁和皮肤。我们的持针器带有内置剪刀，可简化缝合操作。

我们更倾向于对腹壁和皮肤均采用连续缝合。每隔一针打结一次，以在切口部位提供额外支撑。在将动物放入恢复笼之前，皮下注射非甾体抗炎药物。

请咨询您的兽医团队，了解您所在机构的动物护理与使用委员会推荐使用哪些预防性镇痛药物。将母鼠置于无菌铺巾内，并放置在加热恢复笼底部。恢复笼内应包含筑巢材料、一根用于遮蔽的红色管子、实验鼠粮和一个饮水瓶。

术后第二天早晨，将笼子重新组装，并在顶部安装过滤罩。母鼠毛发整洁，活动自如，能够用后肢站立以探查打开的笼顶。腹部缝合线干净、干燥，无裂开、红肿或肿胀迹象。

我们附加了一份讨论子宫内基因转移动物护理方案制定的文件。该文件包含一些可能对您在与动物护理与使用委员会协商时设计机构特异性方案有用的表述。第四部分，代表性结果。

代表性结果图A和B显示了出生后第6天幼鼠的代表性耳蜗，该幼鼠在胚胎发育第11.5天时通过耳蜗注射接受了增强型绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒，并进行了电穿孔。耳蜗侧壁从耳蜗中回至顶回被去除。从耳蜗基底回至中回仅可见GFP表达，且其分布与图B中毛细胞标志物肌球蛋白VIIA的分布一致。图C显示了胚胎第11.5天的低倍共聚焦投影图像。

18.5天小鼠耳蜗器官经肌球蛋白VIIA抗体免疫染色，转染细胞分布于整个耳蜗器官中。图D显示了18.5天胚胎期小鼠耳蜗器官经cin.Seven染色的高倍共聚焦投影图像。

在内毛细胞、外毛细胞、指间细胞、柱状细胞和TER细胞中均检测到GFP表达。在胚胎第11.5天通过电穿孔介导的基因转移将基因转染至耳囊，转染的前体细胞可分化为柯蒂器官内所有组分细胞类型。