使用流式细胞术从鼠内耳组织中分离表达LacZ的细胞

以下实验的总体目标是通过流式细胞术从新生小鼠耳蜗中分离出LAX Z阳性细胞。首先在相对较短的时间内分离出大量小鼠耳蜗，以保持细胞活性并获得足够的起始组织；第二步，将LAX Z阳性细胞解离并进行标记，以准备组织分选。

随后通过流式细胞术对细胞进行分选。所获得的 LAX Z 高表达和 lax 低表达细胞群体可用于进一步的实验。该方法有助于回答耳科学研究领域中的关键问题，例如内耳中存在哪些基因表达谱或特定的细胞群体。

演示该操作的是来自我们实验室的医学生 Taha Gen。首先，将 HBSS 加入 35 毫米的培养皿中，并将其置于冰块上。随后，使用虹膜剪对 12 至 15 只已处死的出生后 0 至 3 天大的 Axon2-LacZ 报告基因小鼠及野生型小鼠进行断头处理。

将头部置于冰块上的60毫米培养皿中。接着，使用5号Dumont镊子和虹膜剪剪除头部的下颌和舌头，然后在腭部水平处切开颅底。现在去除颅骨上方的皮肤，并将剪刀从枕骨大孔下部插入至腭部中线，横断颅底。

用剪刀从腭部切口边缘向颅骨顶部两侧各做一道切口，注意避免损伤耳囊。然后从颅骨顶部框架和枕骨大孔处开始，向硬腭的冠状切口方向做两道呈45度角的切口，以完成颞骨的分离。

然后将分离出的颞骨放入含有 HBSS 的 35 毫米培养皿中，并置于冰块上，再将冰块转移至无菌解剖罩内。接下来，取另一只 35 毫米培养皿，加入 PBS，并将其放置在冰块上。使用两把 55 号镊子。

从覆盖耳囊的颞骨上轻轻移除皮层、脑干和小脑，开始显微解剖。随后，在不移除耳囊的情况下，从前庭蜗神经进入处开始，逐步凿除耳蜗囊的部分结构，并继续深入至耳囊内部。暴露耳蜗基底部后，轻柔地取出柯蒂器官及其周围组织。

然后从基部开始，去除残留的螺旋神经节和血管纹，并将耳蜗转移至盛有PBS的培养皿中。用移液器吸取50微升无菌PBS，滴加到未经包被的六孔培养板的一个或两个孔的中央。随后，将不超过20个轴突、两个乳酸性耳蜗组织转移至每滴PBS中。

接下来，在37°C水浴中将50微升0.125%胰蛋白酶预热约两分钟，然后将胰蛋白酶加入耳蜗中，注意不要晃动培养皿。

将耳蜗在 37 摄氏度下孵育 8 分钟。每滴中加入 50 微升大豆胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶消化反应，然后将 P200 移液器调至 125 微升，再向每滴中加入额外的 50 微升完全培养基。使用 300 微升的钝头移液吸头轻轻吹打细胞 80 次，注意避免产生气泡。

随后，待每个液滴均完成吹打后，向其中各加入额外的200 µL完全培养基。现在将细胞通过40 µm细胞滤网转移至同一六孔板中的新孔中，然后将每孔中的细胞分别转移至各自的普通离心管中。

接下来，将100 µL野生型细胞分别加入三个试管中，仅对CUG组用300 µL完全培养基进行稀释。对照组将10 µL轴突、两个LAX Z细胞加入390 µL完全培养基中稀释。将剩余的轴突两个LAX Z细胞转移至含有400 µL OTs的传真管中。

然后将试管置于37摄氏度的湿润培养箱中孵育10分钟，随后向每支相应的离心管中加入200 µL稀释后的CUG。接着，避光保护所有试管，将细胞在37摄氏度的湿润培养箱中孵育25分钟。在细胞孵育期间进行染色操作：取10 mL freshly prepared heaps加FBS，放入15 mL离心管中，并将该管置于冰上。

然后，在关闭光源的无菌操作台中，向每支离心管中加入 1.8 毫升冰冻堆溶液，以尽量减少光照暴露。接着，将细胞在室温下以 1200 RPM 离心 5 分钟。随后弃去上清液，并将沉淀物重悬于 300 微升完全培养基中。

将分选样本的所有等分试样合并，然后向每管中加入碘化丙啶，使其终浓度为每毫升1微克。最后，再次将细胞覆盖后置于冰上。通过首先收集未染色的野生型细胞1000个事件，确定前向散射与侧向散射图上的细胞分布，从而设置分选门。

根据需要调整前向散射和侧向散射参数，然后使用未染色的野生型、PI 染色的野生型以及 CUG 染色的轴突进行补偿。两个 LAX Z 细胞。

用500微升完全培养基填充两支流式管。然后开始分析，对野生型PI染色和axon two Lae CUG染色的细胞进行设门，根据前向散射与侧向散射图排除碎片。使用前向散射高度对前向散射面积图排除双联体和细胞团块。

然后根据前向散射面积与PE sci five面积图排除PI阳性的死细胞。针对每种门控设置，建立前向散射面积与Cascade蓝或Pacific蓝面积的散点图。使用野生型细胞的设门参数及对应图谱，分析分选样品管中来自含axon two laxy PI和CUG染色细胞的10,000个事件。

创建级联蓝高信号细胞的门控，其细胞数量少于总事件数的1%。此时，级联蓝高信号门控应包含Axon two laxy样本中约15%至20%的细胞。利用Axon two laxy细胞分析图，按照上述门控策略，对Axon two高信号细胞进行分析，并创建一个包含最少荧光信号、占细胞总数15%至20%的门控。

将细胞分选到含有完全培养基的分选管中，分选过程中将收集管置于4摄氏度的冷却室中。记录流式细胞仪针对这两个图中每个细胞群所计数的细胞数量。左侧为解离的野生型，右侧为axon two LA Z，显示其侧向散射面积与前向散射面积的关系。

图中显示了耳蜗细胞。注意，与靠近Y轴标记为碎片阴性群体的事件相比，更大尺寸的各个事件群的门控情况。在这两个图中，通常可从野生型和axin two LAX Z耳蜗中回收40%至45%无碎片的细胞。

使用前向散射高度与前向散射面积的关系图，排除先前设门去除碎片后仍存在的双联体。偏离该图预期线性趋势的阴性细胞群事件将被排除。此处理步骤通常可在指定门内获得71.1%的事件数。此处。

通过PE SCI五通道检测的碘化丙啶用于排除死细胞，如这些散点图所示。分选的细胞中约有95%具有活性，未摄取本图中所示的PI（碘化丙啶）。级联蓝通道用于检测荧光底物CUG，如右侧图所示。

平均而言，CUG阳性细胞中约前20%为高表达细胞，相当于约15,000条轴突，每10至12只动物中有两个高表达细胞。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用流式细胞术从内耳组织中制备和分离高表达细胞，以用于细胞命运追踪实验以及基因表达谱分析等实验。