从小份人血样本中单核细胞和树突状细胞谱系特异性Toll样受体介导信号通路的定量成像

以下实验的总体目标是展示如何利用成像流式细胞技术，对来自明确患者队列的原代免疫细胞的细胞机制进行定量分析。该目标首先通过分离来自患者或健康志愿者血液样本的外周血单个核细胞（pbmc）来实现。细胞分离后，进行激活并进行荧光标记。

接下来，细胞通过流体动力学聚焦，用激光激发，并在时间延迟积分CCD相机上成像。最后，利用成像流式细胞仪获取图像，并对NF-κB进行定量分析。

使用ideas软件对每张细胞图像中的转位进行分析。最终，通过分析点图、直方图和细胞图像，可以确定各受试组之间的差异。图像流式细胞术的优势在于其能够结合形态学信息与免疫荧光数据。

我们能够以谱系特异性的方式研究细胞信号通路，无论是单个细胞还是细胞群体，且仅需少量血液样本即可开始。该方法有助于通过定位和定量信号中间分子来解答知识领域的关键问题。例如，可用于研究由作用介导的转录因子核转位，或考察衰老对细胞生物学的影响。

我实验室的一名负责人将在分离自人类志愿者的外周血单个核细胞后，演示该技术。将回收的外周血单个核细胞以每0.6毫升培养基含3×10⁶个细胞的浓度重悬，然后将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中。接着，用一种激活剂（例如此处所示的TLR8激动剂R848）刺激部分细胞，随后将所有细胞置于含5%二氧化碳的培养箱中，于37°C孵育10至60分钟。

孵育结束后，在室温下以500 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液，加入针对单核细胞或树突状细胞谱系的表面抗体混合物，在4摄氏度下标记细胞20分钟，同时设置仅标记单色偶联抗体的细胞管作为补偿对照。随后在室温下用4% PFA-PBS固定细胞10分钟。在室温下以500 × g离心10分钟后，将pbmc重悬于冻存缓冲液中，并将细胞储存于负80摄氏度，直至检测当天进行分析。

将细胞在37摄氏度水浴中快速解冻，离心去除冻存缓冲液后，加入100 µL BD破膜洗涤缓冲液进行破膜处理。然后在室温下用抗细胞内信号组分抗体（如本实验所示的抗NF-κB p65抗体）孵育20分钟。离心沉淀细胞后，将细胞重悬于含 goat anti-rabbit IgG 的100 µL BD破膜洗涤缓冲液中。

加入Alexa 647，室温下再孵育PBMC 20分钟。成像前立即用核染料对细胞进行复染：首先启动ImageStream仪器，然后运行Inspire软件。接着，点击加载默认模板，然后选择初始化流体系统。

然后点击图像库菜单并选择全部。接着按运行设置以开始对微珠进行成像，然后选择明场通道。待速度微珠开始运行后，点击“辅助”选项卡下的“全部启动”以校准并测试仪器。

在完成 ImageStream 系统的校准后，按下冲洗、锁定并加载按钮，将最亮的样本载入仪器。然后调节激光功率，使每种荧光染料在点图中测得的最大像素值介于 104,000 计数之间。随后设定细胞分类标准。

现在点击运行，采集以收集并保存实验数据文件，以便首先分析数据文件，打开分析软件。创建补偿后的图像文件，然后根据正常的细胞核染料强度和高细胞核染料长宽比对事件进行设门。为了在R1门中将单个细胞与碎片或多细胞事件区分开，单核细胞位于CD14阳性细胞门内，而髓系树突状细胞（CD11c高表达、CD4低表达且lin1标记物阴性）位于R3门内。

最后，使用 Ideas 软件分析细胞质转录因子 NFκB 与核染料的共定位情况。NFκB 与核染料之间高度相关，表明两种标记物共定位，反映为较高的相似性评分，提示细胞的活化程度。可通过比较不同处理组或患者群体间高相似性事件的百分比，评估细胞功能活性的相对效率。

然后可以使用软件显示来自群体直方图关键区段的细胞图像。ImageStream 可直接从外周血单个核细胞（pbmc）对细胞亚群进行设门，并对设门后但未分选的细胞群体进行细胞反应成像。此处定量分析了 TLR 信号转导对 lin one 阴性、CD four、微弱表达 CD 11 C 阳性髓系树突状细胞中 NF kappa BP 65 核转位的基线水平影响。

在未受刺激的细胞中，观察到有较高比例的细胞其转录因子NF kappa B p65位于细胞质内。刺激后，经处理的细胞显示出NF kappa B p65与核染料PI具有显著更高的相似性评分，表明NF kappa B p65在刺激后转位进入细胞核。同时采集的未处理组或R848刺激组细胞群体的数字图像展示了代表性细胞以及NF kappa B转入细胞核的强度。请注意，与未处理细胞相比，R848刺激组中NF kappa B和PI在细胞核内的染色强度更亮。

我们已在来自不同年龄供体的细胞中应用了该技术，并揭示了TLR介导的NF-κB激活通路的差异。一旦掌握，该技术可在一天内完成，另需额外时间进行图像分析，从而同时获得多种定位图像和群体统计结果。此外，我们可直接对多个细胞群体的响应进行成像，而无需物理分离。成像流式技术可广泛应用于多种细胞机制研究，在转化医学研究中具有重要价值。