超灵敏单分子阵列数字酶联免疫吸附测定法的开发与验证：用于人干扰素-α

该方法有助于回答关于干扰素诱导反应在不同疾病环境（包括自身免疫和感染）中的性质、调控机制及生物学影响的关键问题。该技术的主要优势在于其前所未有的灵敏度。该技术在生物标志物发现方面具有巨大潜力，可通过前所未有的灵敏度定量细胞因子，从而改善多种疾病的患者管理。

采用该方法的一个关键步骤是中和与自身免疫性多内分泌腺病综合征I型患者相关的活性。首先，将2.8亿个顺磁性微珠加入一个微量离心管中，并记录体积。然后短暂离心微珠，并将试管置于磁力分离器上静置一分钟。

移除并弃去稀释液，从而分离出磁珠。接着，用BWB缓冲液洗涤磁珠两次，再用BCB缓冲液洗涤两次。每次洗涤时，加入200 µL缓冲液，并涡旋振荡试管5秒。

然后使用磁力架将磁珠与溶液分离。分离一分钟后，弃去上清液。接着，每体积磁珠加入190微升BCB。

然后短暂涡旋混匀离心管，脉冲离心，并将洗涤后的磁珠置于冰上。为活化磁珠，将1毫升冷的BCB与10毫克EDC混合，涡旋至溶液均匀。由于EDC本身不稳定且其溶液具有危险性，操作时应迅速且注意安全。

然后向珠子悬液中每体积珠子加入10 µL冰冷的稀释EDC溶液，并短暂涡旋混匀珠子。接着将珠子置于室温下振荡30分钟。为将抗体偶联到珠子上，首先涡旋并瞬时离心活化的珠子。

然后将磁珠置于磁力架上静置1分钟，弃去BCB上清液。接着将离心管从磁力架上取下，用200微升BCB缓冲液洗涤磁珠两次。随后涡旋混匀，短暂离心，再进行磁力分离以去除缓冲液。

然后，迅速向活化的磁珠中加入 200 µL 冷的、已置换缓冲液的抗体。将磁珠涡旋混匀后，将悬浮液置于室温摇床中，以 1,000 RPM 振荡两小时。首先对包被抗体的磁珠悬浮液进行瞬时离心，然后使用磁力柱去除缓冲液。

接下来，使用低体积分光光度计检测缓冲液中蛋白质的浓度。此时抗体已与磁珠结合，任何高于零的读数均表明磁珠上的抗体已达到饱和。

现在，用 200 µL BWB 洗涤磁珠，洗涤步骤与之前所有洗涤步骤相同。然后，将上清液转移至新离心管中，并检测蛋白浓度。通过定量从磁珠释放的蛋白，可测定抗体偶联效率。

然后，再次用 200 µL BWB 洗涤磁珠。接着，加入 200 µL 封闭缓冲液，涡旋振荡管子 5 秒钟，并将其转移至室温摇床中孵育 30 分钟。30 分钟后，磁珠即完成封闭。

然后，使用 200 微升 BWB 缓冲液洗涤一次，随后每次用 200 微升珠子稀释缓冲液洗涤两次。接着，将包被并封闭后的珠子储存在 200 微升珠子稀释缓冲液中，置于 4 摄氏度环境中。本视频部分介绍了如何在自制配置模式下使用单分子阵列分析仪软件优化检测条件的策略。

首先，在两种抗体组合中，测试不同组合的偶联捕获抗体的磁珠与生物素化标记的检测抗体。接着，测试三种不同浓度的捕获抗体与两种不同生物素化比例的检测抗体和捕获抗体之间的组合，反之亦然。然后选择检测限最低的组合，并将其用于后续步骤。

在这种情况下，生物素与抗体的比例为30:1时，可获得最佳的检测限。接下来，比较两步法与三步法配置。三步法配置包含三个不同的孵育步骤。

一种用于包被捕获抗体，一种用于包被检测抗体，第三种用于SBG酶标记。双步法配置将捕获和检测孵育步骤合并。根据制造商的说明，使用预先在分析仪中设置好的双步法和三步法配置，结合所选的捕获抗体与检测抗体浓度及比例，运行单分子阵列分析仪。

然后选择灵敏度最高的配置，并在后续步骤中保持该配置。在此情况下，两步法配置在每个测试点均表现出略高的灵敏度。接下来，优化检测抗体和SBG的浓度。

使用三种不同浓度的检测抗体与三种不同浓度的SBG进行测试。选择能够提供最高灵敏度的浓度组合，并在后续步骤中保持使用。在本实验中，0.3 微克/毫升的抗体和 150 皮摩尔的SBG具有最佳检测水平，背景信号低，且偶然出现中等幅度信号。

有关进一步的优化步骤，请参阅文本方案。其中包含优化检测特异性和可重复性的操作流程，以及蛋白质竞争检测方案。采用经优化后可检测13个亚型干扰素-α的检测方法，对系统性红斑狼疮（SLE）患者、幼年型皮肌炎（JDM）患者及健康对照者的血浆和血清进行了分析。

在两个疾病队列中均检测到高水平的干扰素-α蛋白。虚线表示一种常规的市售ELISA试剂盒的检测限，该试剂盒无法检测到这些患者群体中的干扰素-α蛋白，尽管该细胞因子在这些疾病中具有已知的重要作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何开发并验证针对您所选分析物的单分子阵列检测方法。

在进行该实验操作时，重要的是要记住抗体的选择过程。自该方法建立以来，已使得对干扰素-α在多种自身免疫性疾病和感染中的作用有了更深入的认识。该检测方法还被用于监测对新疗法的反应，并鉴定出导致某些自身免疫性疾病的细胞因子。