活细胞中亚细胞水平及秒级时间尺度下小GTP酶活性的时空操控

本视频展示了一种利用紫外光调控细胞质膜上蛋白质活性的方法。具体操作为：将细胞共转染带有膜锚定FRB蛋白和目的FKBP融合蛋白。随后向培养基中加入光笼型雷帕霉素衍生物。

随后在活细胞成像过程中，对细胞的特定区域施加紫外光。雷帕霉素与生物素之间的连接子被切断，释放出化学二聚体分子及其副产物；释放的二聚体分子扩散进入细胞，并诱导FKBP标记的目标蛋白与质膜锚定的FRB在照射区域发生二聚化。在无紫外辐射的情况下，FKBP与FRB不发生相互作用，因而不产生任何效应。

数据分析显示，基于其生理效应，FKBP融合的目的蛋白呈现出高度局部化的招募。与药理学和遗传学方法等现有技术相比，该技术的优势在于作用速度快、靶向特异性强以及空间分辨率高。该技术的应用意义延伸至癌症治疗领域，因为癌细胞的迁移是导致癌症转移的后果。

因此，调控关键迁移因子的活性可能揭示其精确的分子机制，这是实现其治疗和治愈的前提。演示该实验操作的人员为本实验室的研究生克里斯·保罗·迈耶（Chris Paul Meyer）和技术员鲍勃·德罗泽（Bob de Rose）。开始本方案时，先在无菌微量离心管中混合以下组分：质粒DNA、膜锚定的荧光标记FRB-FKBP融合蛋白、TIA-1以及去离子水；向混合物中加入一微升的几基因HD，然后涡旋振荡。

将试管在室温下孵育 20 分钟。孵育期间，向玻璃八孔腔室的每个孔中加入 50 µL 多聚赖氨酸，孵育 1 分钟以包被表面，然后吸除溶液，并用 50 µL 去离子水洗涤每个孔的中心区域。接下来，用胰蛋白酶处理 80% 至 85% 汇合的 NIH 3T3 细胞。

细胞脱落后，加入 10 毫升含 10% FBS 的 DMEM，将 375 微升细胞悬液转移至 15 毫升无菌离心管中，在 1,500 ×g 下离心 3 分钟。离心结束后，小心吸除上清液。加入 750 微升含 10% FVS 和 Resus 的 DMEM。

通过轻轻吹打数次重悬沉淀。最后，将细胞悬液加入转染溶液中，用移液枪头轻轻搅动，向培养板的每个孔中加入250 µL细胞转染悬液。轻轻混匀后放入培养箱孵育。

37摄氏度孵育15至18小时。为合成笼状雷帕霉素生物素加合物，首先在无菌离心管中用DMSO配制1毫摩尔/升的CRB储备液；另取一个1.5毫升微量离心管，将1毫克avidin溶于250微升PBS中。

接下来将保护基团与雷帕霉素偶联。向溶解的AVID中加入0.5微升CRB储备溶液，通过反复倒置混合，室温孵育15分钟。为获得CRB-AVID偶联产物溶液并去除未结合的小分子，纯化CRBA时，用300微升PBS平衡G-25凝胶过滤柱。

柱子平衡后重复五次。将125微升CRBA溶液加至柱床中心。然后在室温下以800 ×g离心两分钟，收集流穿液于1.5毫升微量离心管中，用于细胞转染后处理。

更换为不含 FBS 的 DMEM 培养基，使细胞处于无血清培养条件，孵育 12 小时。孵育结束后，轻柔吸除培养基，并加入 250 微升预先配制的 1 微摩尔 CRBA 溶液。接下来，为观察活细胞中的蛋白质动态变化，使用配备紫外照明的转盘共聚焦显微镜，耦合 365 纳米波长的紫外 LED 光源进行光学成像。

使用落射荧光光源。通过使用涂有荧光染料的玻璃板（该染料可被紫外光激发）来定义照明光斑的坐标和尺寸。这可以精确调节需要照射的区域。

将带有细胞的腔室载玻片置于载物台上，使用100倍物镜和落射荧光进行观察。调节焦距使细胞清晰可见，并找到一个细胞。在成像前，首先确定生理效应的背景水平，然后开始对细胞进行成像。

在此，通过在细胞选定的一个象限照射紫外光来测量膜皱褶，使光敏保护基团解笼，从而释放出原始的雷帕霉素（溶于DMSO，再用PBS稀释至终浓度为400纳摩尔）。向成像腔室中加入100微升该溶液，以诱导全局效应。每15秒采集一次荧光图像，持续20分钟，以确定RAC的局部激活是否能够诱导局部皱褶形成。

将YFP标记的RAC激活剂FK bp、TIA one和LDR（一种膜锚定蛋白）转染至NIH 3T3细胞中。在1063秒时，对细胞边缘（由黄色圆圈指示）进行FRB定位的照射，随后用汞灯进行为期一秒的全局照射。由此可见，实验开始时几乎未出现膜皱褶现象。

然而，在局部光照后，经过全局光照并添加雷帕霉素，观察到空间受限的膜皱褶现象。雷帕霉素可诱导 FK bp TIA 1 转位至质膜。该细胞表现出全局性的皱褶形成，表明先前观察到的局部皱褶形成是由 RACK 的空间受限激活所引起的。为了进行定量分析，将靶细胞分为四个象限，并测定在局部刺激以及全局刺激后每个象限中皱褶形成的频率，如本图所示。

在未进行紫外线照射或局部紫外线照射、且培养基中不含CRBA或腺苷的情况下，所有观察到的细胞均未出现皱褶形成。然而，当加入CRBA并进行紫外线照射时，在全局照射条件下，所有四个象限中均观察到皱褶形成，发生率大致相同，约为90%；当仅对第一象限进行照射时，第一象限的皱褶形成频率为100%，而第二至第四象限分别为30%、25%和30%。这些结果表明，雷帕霉素的局部解笼可被用于在单个细胞内诱导高度局部化的生理效应。

在此情况下，由 Rack 激活引起的膜皱褶。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用光实现对小 GTPase 活性的时间与空间精确控制。该方法可应用于任何依赖特定蛋白质向质膜转位的生理过程。

进行该实验操作时，重要的是要记住每次实验均需 freshly prepare 溶液、试剂和细胞。切勿忘记，使用紫外光可能具有极高危险性，因此必须始终佩戴紫外防护眼镜等防护装备。