利用机器人显微注射技术在脑切片中对单个神经干细胞和神经元进行操作

该技术使得研究人员能够更深入地观察活体组织中的单个细胞。通过追踪和操控单个细胞，我们可以更好地理解发育过程中组织的形成机制。对该方法的可视化演示有助于潜在使用者判断该技术是否对其研究工作有所帮助。

此外，它还能使用户直观了解应用程序的运行过程，而仅通过文字描述则难以理解。该方案可应用于任何具有可评估表面的组织。我们已针对同一组织中的不同细胞、同一物种中的不同组织，以及不同物种进行了研究。

在尝试本实验方案时，保持专注并快速操作非常重要。所有设备应在开始解剖前准备就绪。首先安装自动注射软件，并使用微量移液器拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制显微注射用移液针。

将移液器存放至多三天，并防尘保存。使用微波炉熔化3%宽范围琼脂糖。将琼脂糖置于37摄氏度水浴中，防止其凝固。

解冻一份 SCM，并使用水浴将 10 至 12 毫升 SIM 和 20 毫升 Tyrode 溶液预热至 37 摄氏度。将荧光示踪剂与其他待注射化学品混合，然后在 4 摄氏度条件下，以 16,000 ×g 离心微注射溶液 30 分钟。收集上清液，并转移至新离心管中。

使用前将显微注射溶液置于冰上。采用E13.5至E16.5小鼠胚胎的头部制备端脑的器官型组织切片。用镊子沿中线去除皮肤并打开颅骨。

从打开的颅骨中解剖出胚胎脑组织，并从脑组织腹侧开始去除覆盖在脑表面的脑膜。将解剖完整的脑组织置于盛有台氏液的37摄氏度加热板上。将大范围熔化的琼脂糖倒入一次性包埋模具中。

当温度降至38至39摄氏度时，使用巴斯德移液管小心地将最多四个脑组织转移至琼脂糖中。用刮勺或Dumont一号镊子轻轻搅拌组织周围的琼脂糖，注意不要触碰组织。于室温下静置，使琼脂糖凝固。

琼脂糖凝固后，修去组织周围的多余部分。用 PBS 填充缓冲槽。将脑组织沿前后轴垂直于托盘方向摆放，使用振动切片机切割成 250 微米厚的切片。

用2毫升预热的培养基填充一个3.5厘米的培养皿，然后使用塑料巴斯德吸管将10至15片组织切片转移至该培养皿中。操作完成后，将含有切片的培养皿放入切片培养孵育箱中。在37摄氏度的湿润环境中维持切片培养。

打开计算机、显微镜、显微镜相机、操纵器、压力装置和压力传感器。通过点击从 GitHub 下载的主文件夹中的文件 launch app.py 来启动应用程序，并在弹出窗口中指定设备设置。

为防止发生意外堵塞，在将移液管浸入溶液之前应先建立向外的压力。将补偿压力条滑动至24%到45%，然后点击“设置数值”。接着，通过旋转机械压力阀旋钮，根据压力传感器的读数将压力调节至1到2 PSI。

将切片转移至含有2毫升预热SIM的3.5厘米培养皿中央，然后将培养皿置于已预热至37摄氏度的显微注射载物台上。使用长尖塑料移液枪吸取1.4至1.6微升显微注射溶液，加载至显微注射移液管中，并将该移液管插入移液管固定器内。在显微镜最低放大倍数下，调节切片至清晰对焦，并引导微移液管进入该视野，使其与切片目标区域处于同一焦平面。

将显微镜的输出切换至相机，以查看视野（FOV）和应用情况。点击界面左上角的放大倍数按钮以启动设备校准。当弹出窗口提示选择放大倍数时，选择10X并点击“确定”。软件默认内置物镜为10X。

使用显微镜的微米调节轮重新对准移液器尖端，并用光标单击移液器尖端。接着，按下步骤1.1按钮，并在弹出窗口中点击“确定”。移液器将沿y方向移动。

点击移液器的尖端，然后按下步骤1.2按钮。最后，在移液器角度输入框中输入45，然后按下设置角度按钮。在自动显微注射控制面板中输入所需的参数，并将速度设置为100%。完成后，单击设置数值。

单击绘制边缘按钮，在弹出窗口中沿所需路径拖动光标以定义注射轨迹。进行神经元显微注射时，应靶向端脑的基底侧。将移液管移至轨迹线的起点，单击其尖端，然后单击运行轨迹以开始显微注射。

针对每一个目标注射层面重复此步骤。将脑片浸入胶原混合液中，然后将脑片连同200至300微升胶原混合液转移至35毫米玻璃底培养皿的14毫米孔中。确保脑片被尽可能少的胶原覆盖，这是保证营养和氧气吸收的最佳条件。

使用两把镊子调整切片方向，将培养皿置于37摄氏度的加热板上孵育5分钟，使胶原蛋白凝固。随后将培养皿移回切片培养孵育箱中继续孵育40分钟，然后加入2毫升预热的SCM。培养结束后，从切片培养孵育箱中取出切片，并吸除SCM。

用 PBS 清洗胶原蛋白包埋的切片，然后加入 4% 多聚甲醛，在室温下固定组织 30 分钟。随后将组织转移至 4°C 过夜固定。次日，吸除多聚甲醛溶液，并用 PBS 清洗切片。

在体视显微镜下，使用两把镊子将切片从胶原蛋白中取出。使用微波炉熔化3%低熔点琼脂糖，然后将其倒入一次性包埋模具中，冷却至约38或39摄氏度。将组织切片转移至该模具中，确保切片的剥离面朝上，然后让琼脂糖冷却至室温并凝固。

修剪掉组织切片周围多余的琼脂糖。调整琼脂糖块的方向，确保切面与振动切片机的刀片平行，然后切出50 µm厚的切片。用PBS填充24孔板，并使用细尖画笔将切片转移至孔板中，随后根据标准实验流程进行免疫荧光染色。

此处展示的是成功注射的前体细胞和新生神经元的代表性图像。使用Dextran Alexa 488进行注射时，细胞被染料完全填充。与手动显微注射相比，自动化显微注射可显著提高通量。

此外，EDU标记证实细胞活力不受自动化操作的影响。将脑片组织保持在培养状态，可实现对显微注射细胞谱系进展的追踪。对单个神经干细胞进行显微注射可获得优异的单细胞分辨率。

因此，该方法已被用于解析神经干细胞增殖与命运转变的细胞生物学过程。本方案通过注射 Lucifer yellow 及 Dextran A555，用于研究新生神经元之间的缝隙连接耦合。部分新生锥体神经元通过缝隙连接与邻近神经元相耦合，这一结果支持了未成熟神经元通过缝隙连接进行通讯的观点。

我们已利用该技术研究大脑发育和大脑进化的细胞生物学。我们研究了多个影响神经干细胞行为的候选基因，并成功发现且理解了这些基因的作用机制，它们如何影响神经干细胞谱系的发育进程，以及在大脑发育过程中对神经元生成的调控作用。