Drosophila 行为测定方法

本实验的总体目标是演示检测果蝇运动感觉及协调行为的方法。首先通过爬行实验评估幼虫的运动功能，再通过环形实验评估成虫的运动功能，最后通过求偶实验评估成虫的协调性和感觉能力。最终，这一系列行为学检测可揭示遗传因素和外界因素（如药物处理）对果蝇活动能力和协调性的影响。

在索法拉内。与现有的负向趋地性等方法相比，该检测方法的主要优势在于环形检测具有更高的通量和更高的灵敏度。该方法有助于回答神经退行性疾病领域的一些关键问题，例如运动缺陷的早期检测。

本实验演示将由我实验室的博士后 Jamie Becknell 博士进行。幼虫爬行实验用于检测遗传和环境因素对运动能力的影响。首先，在标准培养瓶中设置杂交，放入 10 至 15 只雄蝇和 10 至 15 只处女蝇。24 小时后，健康的成虫将产下足够数量的卵，使培养瓶中的种群密度适中，并确保所有后代的年龄同步在 24 小时内。

将成虫转移到新的培养瓶中，并重复该过程。现在将培养瓶继续培养，直至观察到瓶内食物中出现三龄幼虫。加入50至100毫升20%蔗糖溶液，静置20分钟。

幼虫将上浮至液面，使用剪去尖端的25毫升血清移液管收集幼虫，并转移至筛网篮中。用去离子水将筛网篮中的幼虫清洗两次。此时即可进行实验操作。

为了用药物处理幼虫，使用毛刷将所需数量的幼虫转移至含有5%蔗糖溶液和目标药物的5毫升烧杯中。让幼虫摄食加药的糖溶液15分钟，然后通过筛网漏斗倒出幼虫，冲洗后继续进行药物对运动能力影响的测定。使用毛刷将单个幼虫转移至含有2%琼脂糖的15厘米培养皿中。

将样本置于嫁接纸片上。现在开始收集数据。只需统计熔岩在一分钟内穿过的网格线数量。

接下来，在解剖显微镜下，使用毛刷将幼虫转移至含有稀释酵母糊溶液的玻璃解剖皿孔中，持续一分钟后开始计数佩尔西幼虫的收缩次数。一次完整的收缩定义为从后部到前部的完整运动。重复该过程，直至完成所需数量幼虫的计数。

环形实验方案通过测量成年动物的运动速度来评估其活动能力。在弱麻醉条件下收集新羽化的成年雄性果蝇，并将其转移至含有正常食物或含药食物的标准培养瓶中。每瓶约放入25只果蝇。将果蝇在室温下饲养两到三天，以确保完全从麻醉中恢复，并达到稳定的药物浓度水平。

然后将约25只未麻醉的果蝇转移至带有模制塞的聚苯乙烯小瓶中，并将小瓶组装到一个或多个环形装置中。让果蝇静置15至20分钟，同时调整数码相机以从侧面拍摄小瓶，准备好计时器并将其设定为所需的检测持续时间，通常为三秒以完成检测。

用一只手握住环形装置，避免干扰果蝇，另一只手迅速握住相机定时器。将装置在实验台上轻敲三次，使果蝇跌落，同时启动相机的倒计时功能。每分钟重复一次实验，直至完成五到六次试验。

在初次收集数据后，严禁重复使用聚苯乙烯测试小瓶。因为将新果蝇放入已使用过的小瓶中，其攀爬程度将不及放入新小瓶中的果蝇。应使用图像查看器对不同组别的平均攀爬高度进行评分以收集数据。

该实验需要预先准备装在瓶中的遗传杂交样本，且杂交后代应大量繁殖，以便收集用于实验的果蝇。在动物主观黎明后的几小时内，清空培养瓶，并每隔三到四小时收集一次成虫。收集新羽化且无交配经验的雄性和雌性果蝇，将雄蝇单独饲养在含有食物的小瓶或试管中，雌蝇则以每组五至六只的方式群体饲养。

在类似的装置中，检测需要相同数量的雄性和雌性果蝇。收集的果蝇隔离培养五天后，准备将其装入交配轮并进行检测。接着，在解剖显微镜下，小心地将一只雌蝇和一只雄蝇转移至交配轮的腔室中。

观察该对果蝇10分钟，或直至它们在此期间成功交配。记录首次观察到每种行为的时间。记录雄性果蝇首次转向雌性果蝇的时间。

当雄性首次用其腿部接触雌性时进行记录，当雄性首次伸展并振动翅膀时进行记录，当雄性首次舔舐雌性生殖器时进行记录，当雄性首次将腹部蜷曲于身体下方时进行记录。记录雄性首次尝试骑跨雌性的时刻。最后，记录从开始求偶行为直至交配发生所持续的总时间。

对于野生型动物，该过程几乎总是在5到10分钟内完成，通过三个不同参数收集数据。第一，行为潜伏期是指首次观察到该行为所需的时间。第二，行为频率是指该行为是否被观察到。

第三，求偶指数是指在动物实验中，求偶行为所花费的时间除以从开始到交配的总时间。携带与肌萎缩侧索硬化相关的 F-U-S-T-L-S 基因突变的个体，其插入突变体的爬行能力仅为野生型对照组的一半，而 R 5 21 C 错义突变则使爬行速度降低至每分钟约一厘米。

野生型年轻成年果蝇的环形测试结果显示，在三秒时间内平均爬升高度为三至五厘米。在本实验中，连续进行五次测试，每次间隔一分钟，在尝试环形测试时未观察到反应下降现象。需要注意的是，实验过程中应尽可能精确地控制时间。

一旦掌握，若操作得当，完成一次幼虫拥挤实验仅需 30 至 40 分钟，即可对一种基因型的 10 次重复进行观察。观看本视频后，您还应充分了解如何观察并评分果蝇的求偶行为。