Drosophila 幼虫中评估热伤害感受的局部与整体方法

以下实验的总体目标是检测果蝇幼虫的热伤害感受。首先收集果蝇幼虫，随后将其暴露于有害的热刺激中，作为可选的第二步。幼虫可接受紫外线照射，从而引起组织损伤并导致热伤害感受的敏化。随后可通过热探针进行局部探测，或通过热板进行整体探测，以诱发可定量测量的伤害感受反应。

热探针实验表明，幼虫对热刺激的伤害性感受反应存在上限，并且输入温度与诱发反应的幅度之间存在出人意料的关系。热板实验显示，幼虫表现出一系列刻板的伤害性感受行为，这些行为依赖于周围水体的温度以及伤害性感受感觉神经元的活动。本文所述方法有助于回答热伤害感受领域的关键科学问题，例如，动物对局部或全身施加的有害热刺激是否表现出不同的反应。

初学者通常难以掌握热探针实验，因为熟练掌握该实验需要反复练习，以尽量减少施加探针时的压力、位置和角度的变异。热板实验的可视化演示至关重要，因为随着温度升高所引发的行为反应必须通过实际观察才能充分理解。为了获得足够数量的目标基因型后代幼虫，可直接培养所需品系，或在盛有果蝇培养基的瓶子中进行杂交：在产卵后五天，使用20至30只未交配雌蝇和15至20只雄蝇进行交配；收集早期三龄幼虫时，先挖出软化的培养基，再用流动的清水通过孔径为630微米的筛网过滤冲洗；随后将早期三龄幼虫转移至一小块湿润的培养基垫上，以防止饥饿和脱水。

构建麻醉室后，使用镊子或画笔轻轻将10只早期三龄幼虫放置在盖子内侧并关闭。在通风橱内操作，将麻醉室放入一个耦合罐中，罐内放置一个含有棉球的10毫升烧杯，棉球用1.5毫升达氏乙醚浸润。旋紧耦合罐的盖子，使幼虫暴露于乙醚蒸气中2至2.5分钟。

完成电击授权后，将电击授权室从 Coplan 罐中取出，在通风橱中静置数秒，使残留的乙醚蒸气充分挥发。使用喷水瓶将幼虫轻轻冲洗出授权室，收集至一个小的培养皿中。用纸巾吸干麻醉后的幼虫，然后将其背部朝上轻轻贴附于一条固定在 3 英寸 × 1 英寸玻璃载玻片上的双面 Scotch 胶带上。

将载玻片置于紫外照射室的底面，以20毫焦耳/平方厘米的强度对幼虫照射紫外线6秒。照射后，将载玻片浸入水中，轻轻使幼虫从双面胶带上漂浮脱落。使用镊子或画笔将照射后的幼虫轻轻转移至15×45毫米的培养皿中。

一个一德拉姆的玻璃培养瓶，内含一毫升果蝇食物，用于在25摄氏度或所需的培养温度下恢复8至24小时，然后再寄生。进行热伤害感受实验时，首先将热探针的温度预设至所需的设定值。使用画笔或镊子将单个幼虫轻轻转移至一个平坦的平台上，确保幼虫被一层薄水膜覆盖。

为了尽量减少压力变化并确保热探针位置和角度的准确性，需要通过练习达到熟练。轻轻将探针尖端以大约 45 度角抵在幼虫的 A4 体节处，探针尖端施加轻微压力。该压力应在幼虫表面产生轻微凹陷，通常足以抑制其运动。

持续刺激幼虫，直至其表现出回避反应或达到第22次截止。表现出反应的幼虫通常首先出现抬头和翘尾的初步行为，随后发生至少旋转360度的卷曲回避行为。一旦回避行为开始，立即移开探针接触，并记录回避反应的潜伏期或所需时间。

如果在20秒内未观察到缩回行为，则该幼虫为无反应个体。调整光纤导光管的位置，以确保提供充足且高对比度的照明。观察幼虫时，将加热模块平放面朝上置于加热板中，然后将加热板放置在显微镜底座上。

将加热板调至高温档，等待约15分钟，使温度稳定在95摄氏度。量取80微升蒸馏水，用微量移液器将水滴置于一个60乘15毫米的聚苯乙烯培养皿中央。用镊子轻轻将一只清洁的三龄幼虫中期样本放入水滴中央，尽量避免带入额外的水分。

将培养皿轻轻放置在加热板的固体加热块上。迅速调整培养皿的位置，使整个幼虫和水滴均在视野范围内。启动计时器。

此时，将培养皿放置在加热板的固体加热块上，并记录每种行为开始的时间。五、将浸在水中的幼虫转移至加热板后，可观察到刻板的运动行为。在无热刺激的情况下，正常行为表现为伞状运动，并伴随有探索性的头部运动。

头部抽搐行为可能在此时出现，即幼虫头部快速地进行前向或侧向运动。这种运动与其在水中正常的运动方式相似，但动作更为急促且持续地伴随翻滚。当幼虫侧向翻滚至少完整一圈（360度）时，即发生该行为。

该行为可能以不同的次数发生，有时涉及不完整的翻滚。在评分时，仅统计完整的360度翻滚。此行为最类似于在鞭状行为期间局部应用热探针时的场景。

幼虫沿前后轴表现出快速的收缩-舒张运动，使头部短暂地接近尾部。抽打动作常连续快速发生，或与翻滚同时出现。最后，幼虫会表现出惊厥行为，通常随后出现麻痹。在惊厥行为期间，幼虫沿前后轴伸展，并表现出高频的全身性颤动。

当幼虫停止运动时，会出现无弯曲麻痹的抖动行为。在部分幼虫中，这种状态是永久性的，而另一些幼虫则随后表现出低频脉动运动。在此表示各分类中响应者百分比的图中，幼虫热伤害感受反应存在上限。在热探针实验中，当探针温度高达52°C时，100%的幼虫均为快速响应者。

然而，在54摄氏度及更高温度下，即使接触20秒，仍有90%或更多的幼虫无反应。尽管这些幼虫在第22次截断后仍继续移动，但其翻滚次数或处于厌恶性退缩行为的时间仍可被测量并绘图。令人惊讶的是，探针输入温度与反应强度之间似乎存在一种反向关系，即较低的温度似乎会引发更多的翻滚次数。

将浸在水中的幼虫转移至加热板后，可观察到五种刻板的运动行为。此处展示了在本实验所述最佳条件下，每种行为出现的平均潜伏期，以及对应各潜伏期测得的平均水滴温度；表现出每种特定行为的幼虫比例介于77%至100%之间。尽管偶尔会出现翻滚与抽打行为缺失、重叠或顺序颠倒的情况，此处仍展示了在加热板实验中出现麻痹行为后幼虫的平均存活率。实验中将幼虫加热至出现麻痹，随后转移至标准培养条件下使其恢复。

对照处理的幼虫接受了除热刺激外完全相同的操作，且在第7至13天时，存活成虫中PPE的形成呈定量状态。此处，MD G四号驱动UAS调控的转基因在全部四类多树突外周感觉神经元中表达。UAS或one delta C表达一种经修饰的果蝇开放整流钾离子通道，该通道为突触传递所必需；而UAS orrc one delta NC则表达同一通道的进一步修饰版本，该版本不干扰突触传递。

请注意，只有同时携带 MD GAL4 驱动子和 UAS ORC1 ΔC 转基因的幼虫，在所观察的五种行为中的四种表现出显著延长的潜伏期。观看本视频后，您应能够充分掌握如何测量果蝇幼虫对有害热刺激产生的局部和整体反应。这些实验步骤可与其他方法（如遗传学分析）结合使用，以鉴定参与热伤害感受所需的基因。在进行热探针实验时，务必注意尽量减少探针的压力、作用位置和接触角度带来的变异。