一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

本视频介绍了一种利用双通道同步采集技术追踪T细胞受体信号事件的方法。首先，通过转染使T细胞表达GFP标记的ZAP-70蛋白，然后将其置于含有脂锚定肽-MHC复合物、黏附分子和共刺激分子的玻璃支持脂双层上，采用全内反射荧光显微镜（TIRF显微镜）进行观察。

当T细胞受体被肽-MHC复合物结合时，将ZAP 70转染的T细胞加入双层膜中。SARC家族激酶LCK磷酸化与T细胞受体相关的CD3链，并将激酶ZAP 70从细胞质中招募。随后对T细胞受体进行荧光标记，并进行成像，其中细胞浸没在折射率低于盖玻片的培养基中，并用以发生全内反射的角度入射的激光束照射。

这会在玻璃与水的界面处产生一种渐逝波，该波在介质中呈指数衰减，穿透深度为100至200纳米。因此，只有位于质膜上或非常靠近质膜的荧光分子才会被激发。对所得图像的分析表明，信号转导发生在T细胞受体微簇中。

草坪显微镜（turf microscopy）或传统共聚焦显微镜的主要优势在于其更高的分辨率，使得信号簇或信号复合物（例如TCR微簇）能够被清晰地观察到。我实验室的两位博士后Travis Crites和Chen将演示如何利用大容量核转染技术（maxi nucleofection technology）转染原代小鼠T细胞，随后通过全内反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscopy，简称turf M）对这些细胞进行成像，成像过程中使用含有抗原的玻璃上双分子脂质层进行刺激。

该方法已广泛用于研究多种免疫细胞中的信号传导，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和肥大细胞。该方法具有广泛的适用性，可用于研究哺乳动物细胞中的大多数受体系统，尤其是当信号传导发生在簇状结构中时。对于初次使用该方法的研究者而言，初期可能会遇到困难，因为T细胞的转染非常困难。

此外，需要精确协调，以确保T细胞的存活率和转染效率、双光子显微镜的质量以及显微镜的校准均达到标准。该实验的第一步是使用AMAXA小鼠T细胞核转染试剂盒，将表达质粒转染至初始态或体外活化的原代T细胞中，这些质粒编码由GFP标记的信号分子。本研究中使用的所有T细胞均表达A-N-D-T-C-R，该受体可识别与MHC分子IE结合的MCC肽。此处所示的转染操作严格按照试剂盒生产商的推荐方案进行。

然而，以下提供了一些有助于提高T细胞转染后存活率的建议。与初始T细胞相比，体外活化的T细胞具有更高的存活率和转染效率，因此本方案在开始前使用体外活化的T细胞。每项转染实验需准备2毫升添加了补加成分的T细胞培养基，方法是在2毫升离心管中加入试剂盒提供的1.9毫升基础培养基、20微升组分A、20微升组分B以及100微升胎牛血清。

将两毫升培养基转移至12孔板的每个孔中。将该板置于37摄氏度的加湿培养箱中至少一小时，以使培养基充分平衡；若将转染后的细胞悬浮于温度过低或pH值不为7.2的培养基中，会导致细胞死亡。为配制转染混合液，取82微升小鼠T细胞核转染效应液，加入18微升辅助液2以及5微克内毒素含量极低的质粒DNA（浓度不低于每微升0.5微克），通过轻弹管壁充分混匀。

将五百万至一千万个细胞转移至一个15毫升离心管中，在室温下以75 × g离心5分钟。离心结束后，使用真空抽吸装置尽可能吸除上清液，然后用转染混合物重悬细胞沉淀，轻柔地反复吹打细胞沉淀3至4次，直至无明显细胞团块残留。使用移液器小心地将细胞悬液转移至经过认证的Amaxa比色杯中，确保无气泡产生。

将 qve 盖帽并选择核效应装置上的核效应程序 X 0 0 1。将 vete 插入 Q vete 持架中，按下按钮以启动所选程序。随后立即将 vete 和预平衡的培养基转移至超净台中。

使用提供的塑料移液管，向培养皿中加入约 500 µL 预先平衡的培养基。然后将细胞悬液一滴一滴地加入培养皿中的培养基里。

将细胞在 37 摄氏度下孵育 4 小时，以实现 GFP 标记蛋白的低水平表达，并最大限度减少因过表达而产生的伪影。在本节中，将在开启显微镜所有组件电源之前，介绍一种用于双通道同步成像的显微镜校准方法。启动计算机和软件。

然后确保所有硬件组件均被软件识别。由于软件启动时无任何错误提示，表明所有组件均已检测到。将一微升亚分辨率样品稀释。

将弗洛雷斯亮色多荧光微球加入2毫升PBS中，用作共定位标准品。然后将0.25毫升微球悬浮液加入Lab Tech八孔腔室盖玻片系统的每个孔中。将腔室载玻片系统放置在物镜上方的平台上。

然后将珠子吸附到玻璃上，并在实时预览中调至清晰对焦。左侧窗格为可见GFP转染细胞的通道，右侧窗格将在活细胞成像实验中显示标记的TCR。

使用XY、Z光纤耦合器的Y轴对准，调整激光束的位置，使光束从物镜射出并投射到天花板上。此操作应在物镜处于玻璃平面聚焦位置时进行。若天花板上的光斑呈发散状，则说明光束未准直。

调整Z微米调节器，使实验中使用的所有激光线均达到完全准直测试的准直状态。然后使用激光功率计，将每个通道的激光功率调节至20至30微瓦。T细胞对激光辐射极为敏感，因此照明总功率需限制在50微瓦以内。

接下来设置草坪的入射角度。旋转光纤耦合端的Y轴对准微调旋钮，使光束逐渐远离天花板，直至其相对于物镜光轴的角度接近90度。

当达到全内反射的临界角时，激光将不再从物镜射出。为了评估是否实现了草坪状排列（turf alignment），需上下调节焦距，穿过盖玻片的平面进行观察。注意，当珠子吸附到表面并逐渐失焦时，可观察到许多珠子漂浮在溶液中。为了实现良好的草坪状排列，有必要增加光束相对于物镜的角度。

随着光束角度的增加，靠近表面漂浮的微珠开始消失，而在界面处吸附的微珠信号强度则逐渐增强。当位于界面处吸附的微珠被移出焦平面时，溶液中漂浮的微珠已完全不可见。此时，草坪已正确对齐，因为只有吸附在盖玻片上的微珠才能保持在焦平面内。

接下来，为了对齐红色和绿色荧光通道的相对位置，请聚焦于微珠，并比较两个通道图像中可识别特征的位置。使用其中一个相机支架上的X和Y微米调节螺钉，将微珠的相对位置尽可能地调整至重合。请注意两个图像中左下象限明亮微珠的位置，以确保两个通道之间的空间对齐。

该特征在两幅图像中均位于相同的相对位置。分别采集并保存两个通道的图像。这些图像将用作共定位标准，以对齐两个通道。

在此处显示的是对齐前的一个示例。如图所示，将亚分辨率微珠的两个通道图像叠加后，可见其中一个通道相对于另一个通道发生了旋转。经过调整后，图像对齐结果如图所示。

可通过比较转染GFP的活细胞图像进一步仔细检查对齐质量。注意两个通道的Laila平台是如何完美对齐的。这是在使用荧光微珠建立的校准方法对两幅图像进行对齐后实现的。

显微镜设置完成后，制备含有玻璃支撑的脂质双层的流动腔室，该双层中呈现抗原，并首先通过turf M技术观察转染的T细胞与基底的相互作用。按照Ana和Dustin描述的方案，组装一个流动腔室，其中平面脂质双层形成于含有NI NTA脂质、黏附分子ICAM-1以及肽-MHC复合物的玻璃盖玻片上。通过组氨酸标签将负载MCC的IEFK掺入脂质双层中。

共刺激分子CD 80被整合。使用GPI锚定，将流动池放置在显微镜载物台上，并通过张力杆将腔室固定到显微镜载物台的适配板上以使其稳定。接着，将制造商提供的加热元件连接到流动池上，以控制其温度。

将物镜置于双层膜上，调焦至双层膜平面，以启动物镜加热器及流动池加热器，使腔室温度升至37摄氏度。孵育4小时后，将截断的T细胞转移至15毫升离心管中，以80 × g的转速离心。用300微升H-B-S-B-S-A缓冲液重悬细胞。然后加入H 57 FAB或H 57单链可变区片段，以标记TCR，FAB的终浓度为10微克/毫升，单链可变区片段的终浓度为20微克/毫升。

将细胞转移至一个5 mL的离心管中。接着，使用1 mL带滑动接头的注射器，通过三通阀将细胞注入流动室。设置成像条件，使双通道活细胞采集显示TCR和GFP通道的实时预览，并找到含有转染细胞的视野。

由于TCR与GFP之间的信号强度差异，可能需要实时调整图像的显示比例，以便在两个通道中均能观察到细胞。如本例所示，可通过聚焦到玻片平面以检测是否存在侧膜染色，从而确认光场照明是否均匀。若侧膜无法清晰聚焦，则表明光场校准良好。

在此实时预览中，当盖玻片处于焦平面以及将盖玻片移出焦点以使显微镜达到良好草坪对准时，均可观察到侧膜染色。增加激光相对于物镜的角度，侧膜将逐渐失焦。随后开始以10秒为间隔采集单张图像和延时序列图像。

细胞在含有每平方微米六个分子的玻璃支撑的INTA双层膜上孵育五分钟，该膜还包含每平方微米100个分子的肽负载组氨酸标签IEFK、每平方微米100个分子的Alexa 647标记组氨酸标签ICAM-1，以及每平方微米100个分子的GPI锚定CD80。在整个成像过程中持续存在Alexa 546标记的H57 FAB片段，同时进行双通道共聚焦显微镜成像。

为了染色TCR，细胞在与双层膜初次接触后一小时内进行成像。使用自动簇集计数软件分析每个细胞中ZAP 70簇集的数量。每种情况下至少分析40个细胞。

加载的肽段在插图中显示。ICAM-1 指的是位于双分子层上的细胞，该双分子层每平方微米含有 100 个 Alexa 647 标记的 His 标签 ICAM-1 分子。如本影片所示（每帧间隔 10 秒），ZAP-70 依赖性信号仅在 TCR 微簇中产生，并且仅对激动型配体产生应答。

在激动剂肽刺激下，TCR信号通过在接触区域周边持续形成TCR微簇并募集ZAP70而得以维持。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用maxa核转染技术转染原代T细胞，并使用turf显微镜正确观察GFPT信号分子向TCR微簇的募集过程。一旦掌握，若操作得当，该技术可在七小时内完成。

在进行该实验操作时，务必注意对原代细胞的操作要格外轻柔。实验每一步中细胞的状态越健康，转染效率就越高，成像时捕获的细胞数量也就越多。T细胞具有高度的运动性，因此在连续进行TCR和GFP通道成像时，由于TCR微簇和细胞本身的移动，会导致两幅图像无法完全对齐。

为解决这一问题，我们开发了双通道同步采集TURF显微镜。