用于荧光显微镜分析膜受体扩散与簇大小的图像处理方案

新的显微镜技术需要开发适当的工具，以正确理解所研究的生物学过程。本方案描述了单分子追踪所需的图像处理步骤，包括细胞膜上分子在整个轨迹过程中侧向扩散参数的估计和斑点尺寸的量化。该方案结合使用了多种软件，包括 ImageJ、MATLAB 和 uTrack，以及一些为此方案专门开发的蛋白质。

本方法以光学显微镜下膜受体的追踪为例进行说明，但也可应用于任何在视频序列中可随时间追踪其轨迹的类颗粒结构。该技术属于基础研究范畴，在临床环境中无直接应用。然而，它可用于辅助表征不同疾病中的生物学事件，从而有助于发现新的治疗靶点。

本方案适用于细胞膜中颗粒的追踪，如本视频所示，也可用于完整细胞、细菌、流体中的纳米颗粒或其他任何其中心位置能够准确确定的物体的追踪。本方案操作友好，仅需具备细胞培养和显微镜技术的相关知识。然而，本方案所采用的多种技术与信息学工具可能会让初学者望而生畏。

通过可视化演示，可帮助研究者自信地掌握该技术。首先，培养Jurkat细胞，用单体GFP标记的趋化因子受体载体转染这些细胞，并根据随附的文字方案，筛选出标记载体表达水平较低的细胞。向每孔已包被纤维连接蛋白的35毫米玻璃底微孔培养皿中加入含有CXCL12配体的培养基或对照培养基，在37摄氏度下孵育1小时。

接下来，将分选后的细胞加入每个培养皿中，在成像前孵育20分钟。孵育结束后，将第一块培养皿转移至TIRF显微镜载物台上，并切换至100倍油浸物镜。使用明场模式定位细胞并进行聚焦，以尽量减少光漂白效应。

然后切换至全内反射荧光（TIRF）模式，并使用低激光强度进行精细调焦。采集时长约50秒的视频，尽量缩短帧间时间间隔。针对每种实验条件的视频文件，按照本视频文字方案中所述的文件结构要求，创建一个新的文件夹。

通过将文件拖放到 Fiji 菜单栏上，使用 Fiji 或 ImageJ 打开视频，并单击“确定”以使用 bioformats 导入 LIF 文件。为了设计掩膜，还需导入相应的多通道图像。接下来，首先使用对掩膜设计有用的通道创建一幅单通道图像，以创建掩膜。

在菜单栏中选择“图像”，然后依次点击“颜色”和“拆分通道”，将不同通道显示为单独的图像。再次通过在菜单栏中选择“图像”，进入“颜色”并选择“合并通道”，将三个通道合并为单一图像。请确保选择正确的通道，然后点击“确定”生成新的非堆叠图像。

通过点击菜单栏，选择“Analyze”，然后进入“Tools”并选择“Sync Windows”，以同步两个窗口。此时将显示一个包含同步图像选项的新窗口。现在，两个窗口已同步，可对两个窗口中的相同区域进行裁剪。

转到菜单栏中的“图像”并选择“裁剪”。使用矩形选择工具绘制感兴趣区域。两个裁剪后的图像将分别显示。

接下来，取消两个窗口的同步。如果尚未创建蒙版，请使用选择工具绘制感兴趣区域并进行裁剪。之后，将视频作为图像序列保存到 Videosec 目录中。

然后选择多通道图像，点击菜单中的 Plugins，选择 Segmentation Editor 以打开分割编辑器插件。选择自由绘制选择工具，用其选中一个绿色标签并设计最外层的掩膜。设计完成后，按下复合窗口中选择选项的加号按钮，所选掩膜即会在查看器中显示。

对所有标签重复此步骤。所有掩膜设计完成后，将掩膜保存为与视频相同的文件名，命名为：mask.tif。打开 MATLAB，通过进入“设置路径”并选择“添加并包含子文件夹”，将 uTrack 目录添加到路径中。

然后，将工作目录更改为包含待分析序列的目录。在控制台中输入 Movie Selector GUI 并按 Enter 键以启动 uTrack。这将打开视频选择窗口。

点击“新建视频”按钮，等待视频添加窗口出现。点击“添加通道”以选择包含视频的目录，并填写视频信息参数。将uTrack结果的输出目录设置为“Results”，然后点击“高级通道设置”，填写与采集相关的参数，最后保存。

制作完视频后，在视频选择窗口中点击“继续”。此时，uTrack 将询问要分析的对象类型。选择“单个粒子”，随后将出现控制面板窗口。

接下来，选择第一步“步骤1：检测”，然后点击“设置”。此时将出现“设置高斯混合模型拟合”窗口。输入此处所示的参数设置，然后点击“应用”。

在控制面板中，单击“运行”以执行检测步骤。几分钟后，按“结果”按钮查看检测结果。视频中会在检测到的颗粒上显示红色圆圈。

如果没有显示红色圆圈，则说明此步骤未正确完成，您应重新尝试。现在，首先按此处所示设置参数，将刚刚检测到的粒子合并为跨越多个帧的轨迹，然后在控制面板中点击运行。

接下来，执行轨迹分析。按照此处所示设置参数，然后点击应用并运行。首先点击结果按钮，验证结果，随后在视频选项窗口中点击显示轨迹编号，逐帧检查每条轨迹是否被正确识别，并手动标记非真实粒子的颗粒。

在 MATLAB 中输入此处所示的命令。该命令将使程序读取所有轨迹并计算扩散系数。接下来，通过提供需要排除的斑点列表，排除对应于错误识别的斑点或轨迹的轨迹。

根据随附的文字方案，计算该细胞每条轨迹的瞬时扩散系数。在此情况下，计算时间滞后等于4时的扩散系数，记为D1至4。完成后，将轨迹分解为短轨迹和长轨迹。

为了分析长轨迹，请输入此处所示命令，通过其矩缩放谱来分类运动类型。分析每个粒子在其轨迹上的强度变化。通过参考随附的文字版实验方案，可以以多种不同方式配置这一基本行为。

然后，收集所有轨迹的扩散系数和强度信息。仅收集短轨迹的扩散系数和强度信息。最后，通过输入以下命令来收集矩谱标度和强度信息，其中 long 是之前使用的后缀。

本方案所述技术可用于对荧光显微镜视频中检测到的颗粒进行自动追踪，并分析其动态特征。通过该分析，可获得不同刺激条件下颗粒行为的多种特征，包括基于四种不同刺激条件下的静止斑点百分比、长度超过50帧的长轨迹百分比，以及沿轨迹运动的类型（分为定向运动、自由运动或受限运动）。

此外，还可以确定扩散系数、平均斑点强度以及每个颗粒上的受体数量。该图显示了在不同刺激条件下，每个斑点的短扩散系数值的分布情况。红线代表中位数值，这张类似的图则显示了在相同刺激条件下，每个斑点在其前20帧中的平均斑点强度。

同样，红线代表平均强度值。由于斑点的平均校正强度与该斑点中荧光蛋白的数量相关，因此可直接计算每个颗粒上的受体数量，如此处所示。MATLAB 是一种区分大小写的编程语言。

您可以根据本方案中描述的变量名称进行调整，但需确保命名的一致性。函数名称不得更改，且逗号、冒号和分号对于正确语法至关重要。单分子显微技术能够以前所未有的时空分辨率对单个膜蛋白进行可视化观察，并为揭示细胞生物学中未曾预料的新现象提供了独特的机会。

该方案为细胞和分子生物学中显微镜视频的定量分析开辟了新的途径。