小鼠中枢神经系统干细胞移植的多模态成像
2012年6月13日
本文介绍了一种优化的多模态成像流程，用于在啮齿类动物脑内对细胞移植物进行多模态成像，包括：（i）活体生物发光成像与磁共振成像，以及（ii）死后组织学分析。在单个动物上联合使用这些成像方式，可实现对细胞移植物的高分辨率、高灵敏度和高特异性的评估。
本实验的总体目标是实现对移植到小鼠脑内的干细胞在体内的行为进行标准化的随访观察。首先，用荧光微米级氧化铁颗粒标记骨髓来源的基质细胞，这些细胞共表达 EGFP 和荧光素酶；其次，将标记了 MPIO 的骨髓细胞（BMCs）准确注射至小鼠脑组织中。
接下来，利用生物发光成像和磁共振成像无创地追踪细胞移植物的存活情况和定位。最后一步是通过死后组织学分析验证活体成像结果。该方法可揭示干细胞移植到小鼠脑内后的行为特征，也可应用于其他系统，如模式生物及疾病研究。
该方法的可视化演示至关重要，因为动物操作步骤难以掌握，静脉注射和脑内注射操作难度较大，且存在影响动物存活的风险。开始此操作时，将75乘以10的6次方个冰蓝微米级氧化铁颗粒加入亚融合生长的细胞培养物中。继续孵育16小时，使细胞通过内吞作用摄取颗粒，随后洗去未被摄取的剩余颗粒。
继续培养细胞 24 小时，以获得细胞共融性和 G-B-M-P-I-O 的均匀分布。随后，通过荧光显微镜观察，计算 EGFP 阳性且 G-B-M-P-I-O 阳性细胞占总 EGFP 阳性细胞的比例，以直观验证颗粒的摄取情况。接着，用 10 毫升 PBS 洗涤标记了 G-B-M-P-I-O 的 BMSC luciferase EGFP 细胞两次。
用胰蛋白酶EDTA处理细胞，随后收集细胞。然后洗涤细胞，并将其重悬于PBS中，最终浓度为每毫升133×10⁶个细胞。最后将细胞置于冰上，直至移植。
在此操作中，通过腹腔注射每千克80毫克的氯胺酮和每千克16毫克的赛拉嗪混合物使小鼠麻醉。等待5分钟后，待小鼠完全入睡，剃除其头部毛发以进行无菌操作。随后将小鼠置于立体定位仪中，并用酒精对皮肤进行消毒。
随后，将药膏涂抹于其眼睛表面，以防止脱水。沿头皮正中线做切口，暴露颅骨，以便定位海马体。使用牙科钻头在颅骨上距离后方2毫米、侧方2毫米处钻孔。
此时，轻轻涡旋震荡细胞悬液，然后用注射器吸取细胞悬液。随后将带针头的注射器插入硬膜下 2.5 毫米深度，静置 1 分钟以使压力平衡。1 分钟后，将针头回撤至硬膜下 2 毫米处。
然后使用自动显微注射泵以每分钟0.70微升的速度注入3微升细胞悬液。注射完成后，额外等待5分钟，以防止注入的细胞悬液回流。接下来，缓慢撤出注射针。
随后，对皮肤切口边缘进行消毒，然后缝合皮肤。皮下注射 300 µL 0.9% 氯化钠溶液，以防止脱水。最后，将小鼠置于加热灯下，使其从麻醉中恢复，以便进行生物发光成像。
使用3%异氟烷、氟和氧气的混合物对小鼠进行麻醉。然后将小鼠置于光子成像仪中。通过将异氟烷浓度调整至1.5%来降低麻醉水平。接着，以每公斤体重150毫克的剂量静脉注射D-荧光素。
使用 photo vision 软件采集图像五分钟。随后，使用 M three vision 软件进行图像处理，并利用固定的感兴趣区域对观察到的信号进行定量分析。进行磁共振成像时，用含3%异氟烷的氧气与一氧化氮混合气体对小鼠进行麻醉。
然后将小鼠放入水平 9.4 特斯拉磁共振系统的固定器中。通过将异氟烷调节至 1% 来降低麻醉水平。接着，为小鼠眼睛涂抹眼膏以防止脱水。之后，使用直肠探针监测小鼠体温。
然后将传感器置于小鼠腹部下方，以监测呼吸频率。将呼吸频率维持在每分钟110 ± 10次，并将体温保持在37 ± 0.5°C的狭窄范围内。随后将表面射频线圈放置于小鼠头部上方。
将小鼠置于磁体中心位置。随后打开 ParaVision 5.1，根据随附的手稿设置序列参数。然后采集一组10张冠状面T2加权自旋回波图像，以获取特定的解剖学信息。
采用NT双星加权梯度回波成像，以70平方微米的平面内分辨率研究干细胞迁移。在此步骤中，处死小鼠并取出脑组织。将脑组织在室温下用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定两小时。
两小时后，将脑组织置于4°C下不同浓度梯度的蔗糖溶液中进行脱水。次日，使用液氮冷冻脑组织，并将组织储存在-80°C，直至准备切片。
使用冷冻切片机将脑组织切成10微米厚的切片。随后，在荧光显微镜下观察未染色的冷冻切片，筛选来自G-B-M-P-I-O颗粒的蓝色荧光以及来自表达EGFP细胞的绿色荧光。然后，继续观察未染色的冷冻切片，检测炎性细胞产生的绿色至红色背景荧光。
所述的冰蓝色MPIO标记方法可实现对BMSC、荧光素酶EGFP细胞的高效标记，可通过荧光显微镜轻松验证。接下来，在将G-B-M-P-I-O标记的BMSC、荧光素酶EGFP细胞移植至小鼠中枢神经系统后，可通过基于荧光素酶活性的活体生物发光成像来监测细胞移植物的存活情况。此外，还可通过基于冰蓝色MPIO铁含量的活体磁共振成像来监测移植细胞的精确定位。
最后，组织学分析验证了生物发光成像和磁共振成像所获得的结果。在细胞发育后，通过随时间推移稳定的EGFP表达证实了细胞的稳定存活。该技术为分子成像领域的研究人员探索神经退行性疾病不同动物模型中干细胞移植后的细胞与分子事件奠定了基础。
观看本视频后，您应能充分理解如何开展分子成像，结合生物发光与磁共振成像技术，并通过死后组织病理学评估对活体结果进行充分验证。
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概述
本文介绍了一种优化的多模态成像流程，用于在活体动物中对啮齿类动物脑内的细胞移植物进行生物发光成像和磁共振成像，并结合死后组织学分析。该方法可实现对细胞移植物的高分辨率、高灵敏度和高特异性的评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞研究
- 成像技术
背景
- 干细胞移植是一种有前景的治疗策略。
- 了解移植细胞的行为对于治疗效果至关重要。
- 多模态成像可增强对细胞移植物的评估。
- 结合多种成像方式可提供更全面的洞察。
研究目的
- 标准化干细胞在体内的行为随访。
- 评估细胞移植物在小鼠脑内的存活情况和定位。
- 通过死后分析验证活体成像结果。
使用的方法
- 用EGFP和荧光素酶标记骨髓来源的基质细胞。
- 将标记的细胞注射到小鼠脑组织中。
- 利用生物发光成像进行无创追踪。
- 采用磁共振成像进行详细分析。
- 进行死后组织学分析以验证研究结果。
主要结果
- 成功标记干细胞并将其注射到小鼠脑内。
- 非侵入性追踪显示细胞移植物存活良好且定位准确。
- 死后分析验证了活体成像结果。
- 该方法可应用于其他模式生物及疾病研究。
结论
- 多模态成像方法为研究干细胞行为提供了有价值的见解。
- 该方法可增进对干细胞治疗的理解。
- 未来应用可能扩展到多种生物系统。
常见问题
行业重要性概述
中枢神经系统内干细胞移植的多模态成像技术可实现对临床前模型中细胞存活率、定位及表型的高可信度定量评估。整合生物发光成像、磁共振成像（MRI）和组织学分析，为基于细胞治疗的机制性风险消除和预测性评价提供了可靠框架。该方法有助于再生医学和神经治疗研发管线中的转化连续性及项目筛选。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在体内直接探究干细胞的命运及植入情况。
- 通过将成像结果与生物学结局相关联，支持机制层面的风险评估。
- 通过长期细胞追踪，促进功能靶点的验证。
- 提高推进细胞治疗候选物的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证的细胞存活与定位成像读出方法。
- 标准化细胞移植物的定量评估，以确保可重复性。
- 实现细胞标记和递送方案的可扩展性评估。
- 支持针对筛选细胞修饰或递送载体的检测就绪性。
转化与临床前研究
- 将成像结果与中枢神经系统模型中的疾病相关终点相匹配。
- 为细胞治疗从发现到临床前验证的全过程提供连贯性支持。
- 基于体内细胞行为实现风险调整后的推进决策。
- 通过多模态数据整合支持生物标志物的匹配。
流程与工作流整合
这种多模态成像工作流程将针对中枢神经系统的细胞治疗的早期发现、先导物识别和临床前验证连接起来。
- Discovery Biology： 通过量化细胞存活率和定位，阐明治疗假设。
- Screening： 提供可重复的定量成像结果，用于比较不同细胞制备样本。
- Analytics： 整合生物发光、磁共振成像（MRI）和组织学数据，实现可靠的统计分析。
- Translational Research： 将活体成像与疾病相关的功能结局相联系。
- Enterprise Reuse： 提供可标准化的平台，适用于多种细胞类型和疾病模型。
运营与企业影响
- 科学价值：提高细胞治疗开发中的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：增强成像工作流程的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：为决策提供依据，优化细胞治疗项目组合中的资源分配。
- 项目组合影响：支持对再生医学资产进行基于风险调整的优先排序和推进。
实施注意事项
- 需要具备分子成像、磁共振成像（MRI）操作和组织学分析方面的专业知识。
- 需要能够使用先进的成像仪器和分析软件。
- 需要跨团队对细胞标记和成像方案进行标准化。
- 通过优化实验方案，可适用于多种细胞类型和中枢神经系统疾病模型。
- 具体应用受限于成像模态的灵敏度和分辨率极限。
