大脑中微小解剖限定区域的DNA甲基化与基因表达优化分析

本实验的总体目标是研究早期生命应激对 DNA 甲基化和基因表达的影响。首先，通过将新生小鼠幼崽进行母体分离以诱导早期生命应激；随后，通过原位显微解剖获取目标脑区（此处为下丘脑室旁核 PVN），并从单个组织穿刺样本中同时提取 DNA 和 RNA。

接下来，对获得的DNA进行亚硫酸盐处理，然后通过亚硫酸盐PCR扩增目标区域。随后将扩增产物连接至载体并转化入细菌中。通过标记基因的表达和PCR片段大小来鉴定转化是否成功。

最后，亚硫酸氢盐测序用于评估甲基化状态。该工作流程的主要优势在于能够方便地分析环境刺激所引发的表观遗传编程。该方法可为生命早期逆境所致的表观遗传编程提供深入见解。

该方法也可应用于其他系统。只要是在高度组织特异性的环境中分析DNA甲基化和基因表达，且组织样本有限的情况下，均可使用。为诱导早期生命应激，需对定时妊娠的C57黑鼠（C57 Black Six）母鼠所产的幼鼠进行母婴分离处理。

从出生后第1天至第10天，每天将每窝幼鼠转移至加热的清洁笼中3小时，而未受应激的对照组幼鼠则保持不受干扰。除每日3小时的分离外，所有幼鼠均与其母鼠共同饲养，直至出生后第21天断奶。随后，幼鼠按性别分组饲养，每笼3至5只，在标准饲养条件下饲养。为开始脑组织采集，将小鼠脑组织从颅骨中取出后立即用异戊烷在干冰上速冻，并在-80摄氏度下保存。

当准备收集组织穿孔样本时，将脑组织从负80摄氏度冰箱中取出，并置于干冰上。从头侧到尾侧对脑组织进行冷冻切片，切为10微米厚的冠状切片。将切片贴附于防脱玻璃载玻片上，并干燥以备结晶紫染色。

可额外制备切片并保存在零下20度，用于后续分析，例如原位杂交。当准备进行穿孔取样时，使用氯化甲基紫对切片进行染色，以识别目标脑区结构。然后使用穿孔针，通过原位显微解剖法，获取直径0.8毫米的目标区域组织样本。

穿孔样本应保存在负80摄氏度。微穿孔操作必须以标准化方式进行，因为基因表达和甲基化具有高度组织特异性，这一点至关重要。使用移液器在400 µL硫氰酸胍缓冲液中匀浆穿孔样本，然后在室温下涡旋振荡。

接下来，将所得裂解液通过29号针头的注射器反复抽吸数次，直至看不到组织块为止。将裂解液等量分装。

一种用于处理RNA，应首先进行；另一种用于处理DNA，可在室温下保存，直至进行RNA纯化。在RNA纯化过程中，加入十分之一体积的醋酸钠、等体积的水相苯酚以及半体积的24:1氯仿:异戊醇，涡旋剧烈混合。每次加入后均需充分涡旋，并将最终混合物置于冰上孵育10分钟，随后离心该混合物。

收集水相，并加入等体积的70%乙醇。使用RNA离心柱试剂盒，进行柱上DNA消化，然后用25 µL水洗脱RNA。

现在使用经过修改的试剂盒方案纯化DNA，修改内容包括加入RN a's消化步骤，并在使用前将洗脱缓冲液和洗脱柱预热至70摄氏度。洗脱柱在70摄氏度下孵育10分钟即可。最后，使用分光光度计测定DNA和RNA的浓度。

典型的PVN穿孔可获得约600纳克DNA和约400纳克RNA，其中约100纳克RNA用于在亚硫酸盐扩增前通过定量PCR进行基因表达分析。使用市售试剂盒处理200纳克分离得到的DNA，以扩增甲基化区域的DNA。订购专为亚硫酸氢盐转化DNA设计的引物。在亚硫酸氢盐PCR中，最佳引物设计至关重要，因为PCR扩增片段的质量和特异性决定了后续步骤的成功与否。

引物到达后，通过预实验确定其最佳退火温度。每次25微升PCR反应体系中，使用2微升经亚硫酸氢盐处理的DNA作为模板。

从95摄氏度下6分钟的变性开始，进行45至50个扩增循环，最后在72摄氏度下延伸5分钟，以扩增混合物。取7微升PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，以验证扩增片段的大小。使用 commercially available 的PCR纯化试剂盒对剩余的PCR产物进行纯化，用于后续连接反应。

如果获得非目标PCR产物，可使用凝胶纯化法分离本方案所需的目标产物。本实验采用商业化的克隆试剂盒。克隆效率在很大程度上取决于插入片段。

因此，如果反复获得的重组克隆数量较少，可尝试更换不同的克隆载体。设置一个10 µL的连接反应，其中包含1 µL载体和3 µL纯化后的PCR产物。用移液器吹打混合反应体系，并于4°C过夜孵育，次日继续操作。

通过经典的乙醇沉淀法纯化连接反应产物，并用产物转化细菌。在电击转化后立即加入1毫升预热的SOB培养基，将转化后的细菌转移至反应管中。在37摄氏度下复苏细菌1小时后，取各菌液100微升涂布于含氨苄青霉素和IPTG的LB平板上。

当菌落可挑取时，将平板在37°C孵育过夜。在96孔板中设置25微升的菌落PCR反应体系，每反应加入3微升2.5毫摩尔的氯化镁。用移液枪头挑取呈阳性的白色克隆，并通过简单浸入的方式将其转移至PCR混合液中。

开始PCR，进行4分钟的变性循环。随后进行10个扩增循环，退火温度为56摄氏度。每个循环的每一步持续30秒。

然后将退火温度降至48摄氏度，再进行30个扩增循环。最后进行一个5分钟的延伸循环。现在将每个产物取5微升上样至琼脂糖凝胶，鉴定含有正确大小插入片段的反应。

使用市售试剂盒纯化目标 PCR 产物，以便利用 Big Dye 终止物循环测序法进行测序。在 96 孔板中，每孔加入三微升 Big Dye 反应主混合液，随后加入两微升经纯化的菌落 PCR 产物。将反应置于热循环仪中运行，程序起始于 96 摄氏度下 1 分钟，随后进行 35 个循环：96 摄氏度 10 秒、50 摄氏度 5 秒、60 摄氏度 4 分钟。

在完成大剂量反应后，使用大剂量纯化板对反应进行纯化。获得测序结果后，利用在线大剂量分析工具或B-I-S-M-A工具分析数据，以确定所研究DNA区域的甲基化模式，从而深入了解早期生活压力（ELS）对精氨酸加压素（VP）表达及其甲基化状态的影响。C57黑鼠按照所述方案进行处理，取下丘脑室旁核和视上核组织以分离DNA和RNA，DNA经亚硫酸氢盐处理后，使用特异性针对VP增强子区域的引物进行扩增，将PCR产物克隆并测序，每只小鼠至少分析20个重组克隆。

通过PCR分析确定了PCR扩增子中所包含的CpG位点的甲基化频率。在P-V-N-E-L-S诱导下，AVP增强子区域的四个位点出现了显著的低甲基化，提示早期生活经历可通过表观遗传修饰标记这一调控区域。相比之下，在视上核（SON）中，AVP增强子的甲基化状态不受早期生活应激（ELS）的影响，说明该表观遗传效应具有组织特异性。在对照动物中，CpG 10位点的DNA甲基化状态与AVP基因表达呈负相关，表明DNA甲基化在AVP基因表达的精细调控中发挥作用。完成该流程后，可对分离得到的RNA进一步开展其他方法，如UPCR，以回答有关分析组织中基因表达变化等其他科学问题。

观看本视频后，您应能充分理解如何研究环境因素或经验依赖性刺激所引发的 DNA 甲基化变化。