电穿孔鸡胚脊髓中差异基因表达的RNA-Seq分析

本实验的总体目标是评估电穿孔处理的鸡胚脊髓中所有基因和样本的表达水平。首先通过在卵内对早期鸡胚神经管的一侧进行转染，随后将胚胎重新孵育至所需发育阶段。实验的第二步是在无RNA酶的环境中分离成功转染的神经管半侧组织，并尽快进行裂解处理。

第三步是分离 RNA，并对样本进行文库构建和高通量测序。最后一步是处理数据集以去除测序产生的假象，将品种比对到基因组，并为每个基因分配表达水平。

最终，通过比较对照组和实验组中的基因表达水平，结果可以显示出差异表达的基因。该方法的可视化演示至关重要，例如神经管解剖过程。由于该操作需要熟练掌握胚胎操作技术，因此各步骤较难学习。

本实验中，胚胎已在神经管部位转化了表达 GFP 的构建体。准备花费两个小时处理多达 10 个胚胎，以从每个胚胎中收集一到两微克的总 RNA。在无 RNA 酶的条件下，使用精细解剖剪刀和 SVE 收集勺将每个胚胎转移至低温环境中。

用DEPC处理的PBS溶液进行所有神经管分离步骤，使用精细镊子去除肢芽之间胚胎整个侧壁区域。将该组织部分转移至新鲜的冷溶液中，组织背面向上。

使用两根精细的玻璃针，在胚胎背外侧神经管与侧中胚层之间的区域，每侧穿刺三个位置。随后将两根玻璃针插入中央的穿刺孔，并沿前后轴（AP轴）方向向外分开。根据需要依次对每个穿刺孔进行此操作，最终使侧中胚层完全分离，将其取出并弃去。

接下来，将胚胎侧放，并将两把镊子的尖端插入神经管与脊索之间。沿前后轴（AP轴）方向将镊子滑动分开，以分离这些结构。用镊子轻轻夹住神经管，同时去除多余的中胚层组织，完成从神经管上清除较大块中胚层组织的操作。

然后轻轻地将神经管转移至新鲜的冷溶液中。使用带有手动泵的玻璃移液管收集所有需要的神经管，并在继续下一步操作前将其置于冰上保存。现在，将每根神经管分成两半。

将尖头镊子插入管腔，撕开顶板，然后用镊子剪开底板，将组织切成两半。在荧光解剖显微镜下，将经电穿孔处理的组织半片与未处理的半片分开。

将分选好的神经管半侧转移至含有新鲜溶液的1.5毫升离心管中。轻弹管壁，使所有组织沉降至管底。随后，以100 ×g离心数秒钟。

然后在明亮的光源下非常小心地吸出上清液。如果吸出组织，应缓慢将其排出，并重复离心。待神经管半段中的溶液完全清除后，向每根神经管中加入 70 微升裂解缓冲液的一半量。

轻轻弹击离心管，并在室温下孵育15分钟，每5分钟 vortex 剧烈振荡一次，然后继续进行RNA的收集以纯化RNA。用于测序时，每个样本至少需要八个神经管半段。其他保存在-80摄氏度的裂解神经管样品可合并至本次收集中。先将其在冰上解冻15至30分钟，随后在室温下完成解冻。

解冻后，剧烈涡旋振荡所有样品，并静置五分钟。再次涡旋振荡样品，然后在15,000 ×g 下离心一分钟。为去除不溶性物质，将上清液转移至新管中，继续进行提取。

使用RNA提取试剂盒，以尽可能高的浓度洗脱RNA完成提取过程。本实验方案需要一个Galaxy网站账户，以确保获得所需的存储配额。首先，通过FTP将FASTQ文件上传至该网站，除非质量值已采用Shred加33编码。

首先，在“NGS 质控与操作”菜单下使用 FASTQ 修剪工具对已上传的数据集进行预处理。若未自动识别，需在属性中将文件类型更改为 FASTQ。接下来，在“NGS 质控与操作”菜单下使用 FAST QC 工具分析数据集的整体质量。

在相同菜单下选择 FASTQ 质量修剪工具，以去除质量较低的 3' 末端。应处理质量分数为 20 或更高的序列。现在转到同一菜单下的剪切工具。

将此工具设置为丢弃长度少于 45 个碱基对的读段。输入接头序列。禁用丢弃含有未知碱基的读段的选项，并选择输出包含已剪切和未剪切的序列。

使用序列修剪工具进行操作。通过该工具修剪测序读段的前端碱基，以去除 FAST qc 检测到的 5' 端序列偏好性。下一步是从 Illumina I 基因组网站下载并解压最新的鸡基因组组装版本。

然后将全基因组的fastq格式文件和基因的注释GTF格式文件上传至Galaxy History。现在通过访问N-G-S-R-N-A分析菜单并选择top hat two工具，将每个样本的测序读段比对到基因组上。从Galaxy History中选择已上传的fasta文件作为参考基因组。

接下来，在同一菜单下选择 cufflinks 工具以构建预测的转录组。对于每个样本，选择用作参考注释指南的 GTF 文件。选择使用序列数据的 FASTA 文件进行偏差校正，并启用多重比对读段校正选项。

然后使用 cuffmerge 工具合并所有组装的转录组。使用该工具时，选择参考注释的 GTF 文件和序列数据的 FASTA 文件。接下来，在 RNA 分析菜单中，继续使用 cuffdiff 工具比较由 TopHat2 为每个样本生成的 BAM 文件。

在转录本字段中，选择由 cuff merge 生成的合并转录组并启用相关选项。使用多读纠正功能，并利用序列数据的 FASTA 文件进行偏差校正。下一步是根据 Q 值列对差异表达表格进行排序，从筛选与排序菜单中选择排序工具。

在不同实验条件下存在显著差异的序列，其第13列的Q值将最低。现在请查看覆盖度图谱。首先，在“选项”菜单下的“bed tools”菜单中使用转换工具，将BAM文件转换为bedgraph文件，禁用无覆盖区域的报告，并选择将剪接条目视为独立区间进行处理。

同时，将覆盖度按一个因子进行缩放，该因子用于归一化实验中所有覆盖度数据。然后使用“转换格式”菜单中的工具，将生成的 bedGraph 文件转换为 bigWig 格式，并将 bigWig 文件作为自定义轨道上传至 UCSC 服务器。在 UCSC 基因组浏览器页面中，选择 GAL4 组装版本，并利用基因搜索功能，通过所述方法对数据集进行可视化覆盖分析；表达空 PS 载体的神经管组织被采集用于提取 RNA。

该实验重复进行了两次，所获得的RNA质量非常高，RIN值达到预期的最优值10。对重复的空载体对照组转录组进行全局比较，结果显示无明显差异，皮尔逊相关系数为0.99。此外，在表达scratch two锌指结构域的实验样本中，比对到scratch two基因序列的读段数量明显增加。

因此，这些方法的灵敏度足以检测到预期的富集效果。观看本视频后，您应能够分离胚胎神经管，并充分理解如何处理和比较IC数据集，通过遵循方案第四部分的硅基分析步骤来鉴定差异表达基因。