肺组织工程操作步骤

本实验的总体目标是体外培养出在形态学和生理学特性上均与天然肺组织相似的肺组织。首先从成年大鼠体内取出心脏和肺组织，然后对肺动脉和气管进行插管，并将插管后的肺连接至生物反应器以进行脱细胞处理。

脱细胞并冲洗后，将肺组织转移至无菌培养生物反应器中，并准备进行细胞接种。该操作的最后一步是将已准备好的细胞群体接种至肺组织的特定区域。最终可通过免疫荧光显微镜观察结果，显示脱细胞后的细胞外基质被高效地重新定植，且细胞表达出具有区域特异性的肺部标志物。

与现有的体外培养肺细胞方法相比，该技术的主要优势在于细胞能够在三维生物来源的基质中长时间维持其分化表型，因此可对其进行长达数周的研究。进行脱细胞处理时，通过血管插管将肺连接至生物反应器盖，再将盖子连接至脱细胞装置。肺上方的玻璃瓶由铁架台及所连接的夹具固定位置。

此时，可去除细胞成分以制备细胞外基质支架，该支架可重新接种细胞材料。本图展示了用于工程化肺组织接种与培养的生物反应器组装示意图。气管插管的鲁尔锁接头连接于气管储液槽与主腔室之间的呼吸回路。

呼吸回路包含两个单向阀，其位置设计使得培养基进出肺部时沿不同路径流动。在灌注管路中临时加入一个小的储液器，用于内皮细胞的接种。

使用脉动泵将细胞从储液器输送至肺部的血管腔室。血管灌注采用滚压泵实现。培养基通过连接的插管灌注进入肺动脉，流经肺部血管系统，再从肺静脉直接流入主生物反应器，随后培养基由此被抽出进行循环灌注。

通过在呼吸回路中注射使肺上皮就位。主腔室包含肺和气管储液器，用于肺的长期培养。当肺组织被取出且动脉和气管正确插管后，新鲜提取的肺应能保持空气而不泄漏。

可通过将肺组织浸没在液体中并充气来验证其完整性，不应出现表明漏气的气泡。开始实验方案时，用含有硝普钠的 PBS 缓冲液对肺组织进行灌注，直至肺完全膨胀但未过度膨胀，立即封闭气管插管，使肺保持膨胀状态。

接下来，用 PBS 和 SNP 在 15 毫米汞柱压力下灌注肺脏至少 15 分钟。随后，取下气管插管上的塞子，使肺脏自然萎陷。如有必要，继续用 PBS 和 SNP 灌注 15 至 30 分钟。

补充 PBS 和 SNP，以确保灌注压力维持在 10 至 15 毫米汞柱。开始长时间脱细胞操作时，将生物反应器盖连接至脱细胞装置，然后将肺连接到盖子上。

利用与Y形套管相连的诱捕锁扣，肺动脉套管应连接至灌注管路，而气管套管应保持悬空。为确保组织完全脱细胞，关键是要防止空气进入系统。动脉和气管套管中的单向阀可通过允许管路内液体反向流动，帮助清除管路中的气泡。

因此，通过注射器排出气泡，确保所有管路中无残留空气。开始灌注脱细胞溶液。使用脱细胞溶液进行灌注。

当灌注通过肺部的溶液体积达到 500 毫升时，理想压力应低于 15 毫米汞柱。此过程通常需要 2.5 小时。流速在最初通常非常缓慢，并在第二小时内迅速增加至约 1 毫升/分钟或更高。

在灌注过程中，需定期取出生物反应器中的脱细胞液，同时确保留有足够的液体以支撑肺和气管插管。当脱细胞液灌注完成后，将肺和生物反应器转移至组织培养超净台。开始器官冲洗时，取下装有脱细胞液的500毫升广口瓶，更换为一个无菌的、最多可盛装一升无菌PBS的无菌广口瓶。

使用真空抽吸或注射器确保管路中无气泡，以10至15毫米汞柱的压力通过血管系统灌注PBS。在脱细胞过程中，采用无菌技术定期从生物反应器中移除废弃的PBS，并更换或重新加满PBS瓶。使用新鲜且无菌的PBS持续冲洗，直至至少有2.5升无菌PBS流经肺组织。

从脱细胞过程开始到冲洗完成，通常需要两天时间。将肺组织转移至新的无菌生物反应器系统中，该系统内含有新鲜的PBS，添加10% FBS和10%青霉素-链霉素，确保整个灌注回路和整个气道管路均充满液体。此后，将使用脉动泵以每分钟5毫米的速度对肺组织进行灌注。

通过含有10% FBS和10%青霉素-链霉素的PBS对肺细胞外基质支架进行过夜灌注灭菌。完成此步骤后，将肺组织转移至37摄氏度的培养箱中孵育一小时，或直至温度达到平衡。为准备使用Ben Nase处理，下一步是对肺组织进行Ben Nase处理。

为了去除每只肺中的残留 DNA，首先准备一支 10 毫升注射器，仅吸入预热的 Ben Nase 缓冲液，另准备一支 10 毫升注射器，吸入用 Ben Nase 缓冲液稀释的 Ben Nase（90 单位/毫升）。停止肺灌注。

然后用 Ben Nase 缓冲液充盈气道，注意避免将空气注入肺部。让肺部自然萎陷一分钟。随后用 Ben Nase 溶液充盈肺部。

再次注意，在用 Ben Nase 充气后避免将空气引入肺部。在 37 摄氏度下，使肺组织在无灌注或通气的条件下静置一小时。一小时结束后，使用生物反应器中已有的含 10% FBS 和 10% 青霉素-链霉素的 PBS 溶液恢复灌注，并在次日继续过夜灌注。

清洗并灭菌后，可对长段细胞外基质支架进行细胞重植前的准备。将P-B-S-F-B-S苯甲酸溶液替换为250毫升培养基，细胞接种前至少灌注培养基一小时，并在接种细胞前立即更换为新鲜培养基。

可用于器官脱细胞的细胞来源有多种。本文将演示使用上皮细胞群体的方法。首先，准备一支含有15毫升所需上皮细胞群体细胞悬液的注射器。

接下来，向气道储液器中加入 80 毫升培养基，并确保所有通气管路中无气泡。然后将生物反应器放入 37 摄氏度的组织培养孵育箱中，并连接用于通气的注射泵。通过将 15 毫升细胞悬液快速注入气管插管，以单次快速推注的方式将细胞接种至肺组织中。

确保主生物反应器的空气过滤器已盖好。然后立即使用注射泵以每分钟 3 毫升的速度缓慢抽取 60 毫升空气，从主生物反应器中单次缓慢呼吸一次。此过程将持续约 20 分钟。

此后让肺脏静态放置约18小时。开始以每分钟约0.5毫升的速度进行缓慢血管灌注。在器官培养期间，灌注通常以每分钟1至3毫升的速度进行。

在上皮细胞培养过程中使用滚轴泵时，通常以每分钟一次呼吸的连续速率提供通气，潮气量为5至10毫升。使用注射泵时，通过周期性地将空气抽出并注入生物反应器，使主腔室内交替产生负压与大气压，从而模拟呼吸过程。由于通气期间需要保持生物反应器的密闭性，因此应每日暂停通气一次，并更换主腔室内的空气。

此外，培养基应大约每三到四天更换一次。在培养过程中，每次应更换总体积的一半左右，以培养肺上皮和血管内皮。在安装于生物反应器中的支架内，我们能够生成可在短时间内参与气体交换的肺组织。

此处展示了天然大鼠肺组织的标准苏木精、嗜伊红和嗜酸性粒细胞染色，以与脱细胞大鼠肺组织的苏木精-伊红（H&E）染色进行对比。最终的脱细胞细胞外基质应完全去除细胞成分，并保留天然肺组织的大体、显微及超微结构特征。H&E染色可用于观察因脱细胞或冲洗不充分而残留在支架上的DNA残留物，从而评估细胞接种及后续肺组织培养的适宜条件。

生物反应器应使细胞在肺的五个肺叶内均匀分布，并实现对细胞外基质支架约70%的覆盖。这些图像显示了经免疫荧光染色后，天然肺组织与重新接种细胞的肺组织的比较结果。对于关键的肺部标志物，培养的细胞群体表达Clara细胞分泌蛋白、前体表面活性蛋白C以及水通道蛋白5（Aquaporin five）。

所有图中，目标标记物显示为红色，DAPI 染色的细胞核显示为蓝色。一旦掌握从脱细胞到退缩的整个流程，若操作得当，可在四到五天内完成。