逆行性荧光染料标记神经、传导束和脊神经根

本实验的总体目标是利用一种简单且低成本的技术，将高浓度的荧光染料或离子敏感性染料导入神经元或任何神经纤维束中。该方法首先制备两种类型的移液管，即一类和二类移液管。然后将一段柔性弹性体管路连接至一类移液管，并施加正压，使目标神经纤维束进入一类移液管内，同时确认已形成良好的密封。

接下来，将二型移液管插入一型移液管中，并使用二型移液管吸取一型移液管中残留的A型脑脊液。然后将染料引入一型移液管，注意避免产生气泡。最后一步是将神经元在避光条件下孵育6至20小时。

最终，在移除 I 型移液管后，该制备样品即可用于体外电生理或形态学研究。与现有的浴式给药、BOS 注射和电穿孔等方法相比，该技术的主要优势在于能够将 D 递送至特定的神经元群体。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如特定神经元的活性、连接性、形态以及分布情况。

通常情况下，该技术需要经过练习，特别是要确保染料不会在一类移液管中被稀释，并且不能有气泡进入其中。开始此操作时，将聚乙烯管置于酒精灯火焰上拉制，以制成两根具有锥形尖端的短移液管。首先，拉制一根尖端较小的一类短移液管，使其能够紧密固定目标根部或组织束。

接着，拉制一支2型移液管，其杆部更长更细，且具有非常细的尖端，可插入1型移液管直至其尖端。随后，将2型移液管连接至EC夹持的19号针头。然后将分离的脊髓置于浴槽中。

在整个上样过程中，用冰冻的脑脊液（A CSF）进行超融合。之后，将一型移液管置于电极架上，使其后端开口可通过一段柔性管路轻松连接至注射器。在此步骤中，首先使用注射器将脑脊液（CSF）吸入一型移液管中。

接着，绘制需要填充的轴突束或神经根。然后从后端开口处移除柔性管路。之后，将二型移液管连接到另一个注射器上。

将其插入显微镜下夹持着轴突束或神经根的第一型移液管中。使用连接在第二型移液管上的注射器抽吸脑脊液（A CSF），使残留的脑脊液刚好覆盖轴突束。随后将第二型移液管从第一型移液管中撤出。

监测 A 脑脊液水平数分钟，以确认轴突束或神经的密封良好。随后，将染料溶解于 A 脑脊液或含 0.2% Triton X-100 的双蒸水中。通过向连接的注射器施加微弱的负压，将溶液吸入二型移液管中，注意避免吸入任何气泡。

然后将装有染料的二型移液管插入一型移液管中残留的A脑脊液（CSF）溶液内，通过向连接的注射器施加轻柔的正压，缓慢将染料释放到A CSF中。注意避免引入气泡，或导致目标组织从移液管尖端内部发生位移。若在注射染料过程中有气泡进入一型移液管，可将二型移液管尖端靠近气泡处，然后通过连接的注射器施加轻微的负压，将气泡吸出。

当释放足够量的染料后，移出二型移液管。接着，根据实验类型，将组织在避光条件下孵育6至20小时。待充分孵育后，轻柔地将电极从组织上撤下。

然后，组织即可用于成像或组织学分析。下图示意图显示了同时向运动神经元、感觉传入神经元和脊髓中间神经元加载三种不同的右旋荧光素偶联荧光染料的过程：通过腹根逆行填充级联蓝葡聚糖（Cascade blue Dextran）至运动神经元，通过背根逆行填充德克萨斯红葡聚糖（Texas red dextran）至骶部感觉传入神经元；绿色荧光葡聚糖则被加载至轴突经由腹索上行的脊髓中间神经元。

图中显示的是骶段脊髓切片的共聚焦图像，其中神经元已被逆行标记。请注意，标记的感觉传入纤维主要位于同侧，仅有少数对侧投射；标记的运动神经元位于灌注的腹根同侧，而如箭头所示，标记的中间神经元则位于其对侧。

通过该操作步骤，还可进一步开展其他方法，以回答有关DI区域神经元的功能连接性、兴奋性与抑制性、窦性类型、分布以及神经递质产生的关键问题。该技术为脊髓与脑干神经生理学领域的研究人员利用离子敏感性染料标记特定神经元群体奠定了基础。观看本视频后，您应能充分掌握如何在离体脊髓的神经元及感觉纤维中应用荧光染料或离子敏感性染料。