利用 Styryl 染料光转化研究突触囊泡池

本视频演示了Styro染料FM 1-43的光转化过程。为了研究黑腹果蝇（drosophila melanogaster）中的突触小泡池，首先解剖果蝇幼虫以暴露腹侧肌肉，从而制备出神经肌肉接头（NMJ）标本。将标本置于含有FM染料的缓冲液中孵育，图中以灰色显示，用于标记细胞膜。

随后通过电刺激或化学刺激诱导其发生物理融合，使囊泡膜内化。刺激后的胞吐作用将用FM染料进行染色。之后洗去细胞外的FM染料，将其从质膜上清除，并在持续高强度光照条件下固定组织。染料被完全漂白，由于二氨基苯的沉淀，呈现出黑色。

随后可通过透射电镜观察该沉淀物。大家好，我是来自德国戈廷根欧洲神经科学研究所Sylvia Olli实验室的Philippe o Paso。今天我们将向您展示一种在神经肌肉接头处进行FM光转换的实验方法。

我们在实验室中采用此方法研究突触囊泡的循环过程。好的，现在开始操作：在解剖显微镜下进行工作。首先，将一只果蝇幼虫背面向上固定在涂有Sylgard的培养皿中。

用注射器针头滴加果蝇生理盐水覆盖组织，用解剖剪沿背侧纵向剪开。随后去除内脏器官。接着，将标本拉伸并再次用图钉固定于Sylgard培养皿中。

随后可利用多个腹侧肌肉来保护本实验中使用的 FM 染料免于漂白。该操作应在弱光条件下进行。用含有 90 毫摩尔氯化钾和 10 微摩尔 FM 1-43 的果蝇生理盐水覆盖夹住的果蝇标本，以化学方式刺激神经。

刺激后在室温下孵育一分钟。移除刺激溶液，将固定好的果蝇放入培养皿中，并置于盛有100毫升果蝇生理盐水的烧杯中，重复浸泡两次，以在化学安全通风橱下清除细胞外的FM 1-43染料。

在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入2.5%戊二醛，于室温下固定神经肌肉接头样本45分钟。用PBS洗涤样本一次，然后将其从培养皿中取出，浸入100毫摩尔氯化铵溶液中15分钟，以淬灭残留戊二醛固定剂中的游离醛基。

用正常的 PBS 清洗氯化铵溶液，将神经肌肉接头制备物置于新的培养皿中，并浸入过滤后的 1.5 毫克/毫升二氨基苯（DAB）PBS 溶液中，在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。将样品置于配备汞灯光源（灯箱内含后向反射镜）的荧光显微镜下，使用相对较低放大倍数的干物镜进行观察。

找到样本后，使用普通的蓝色激发绿色荧光滤光片组，将荧光信号调至聚焦状态。神经肌肉接头在肌肉上呈现为明亮的斑点。

接下来，使用相同的荧光滤光片组，以最大强度照射样品，直至FM D完全漂白。使用20倍物镜时，通常需要30至45分钟即可。然而，光转化所需时间取决于照明强度、DAB渗入样本的程度以及所用物镜的性能。

照射后，在透射光下观察样品。如果光转化已发生，应可见深棕色沉淀物。返回解剖显微镜，然后使用剪刀从幼虫上剪下已发生光转化的区域。

返回解剖显微镜，然后使用剪刀从幼虫中剪下已发生光转化的区域。现在将样本放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的微量离心管中，操作时需在化学安全通风橱内进行，并佩戴适当的安全装备，包括手套和眼部防护装置。

每份样品准备 300 微升 1% 四氧化锇溶液。现在将样品放入带有塑料盖的玻璃烧瓶中，并加入已配制的四氧化锇溶液以进行后固定。在样品孵育的同时，分别配制含 30%、50%、70%、90%、95% 和 100% 乙醇的溶液。

用 PBS 清洗样品四到五次，每次五分钟。每次清洗后，使用塑料移液管将样品转移至新的烧瓶中。最后一次清洗后，将样品转移至洁净的玻璃烧瓶中。

接下来，通过将样品置于系列乙醇溶液中进行脱水。首先在1 mL的30%乙醇中孵育，5分钟后使用移液管吸除乙醇，并更换为1 mL的50%乙醇。

继续进行脱水，将神经肌肉接头标本依次浸入70%、90%和95%的乙醇溶液中。随后将样本在95%乙醇溶液中孵育的次数需多于在100%乙醇中孵育三次。加入两毫升1:1的EIN树脂与乙醇混合液，并将样本置于旋转器上孵育。

室温下旋转孵育100% EIN 2至4小时后，将样品置于敞口烧瓶中，使残留的乙醇挥发4至6小时。将新鲜的EIN倒入模具中，加入制备好的样品，在60°C下孵育36小时。

当EIN包埋样品制备完成后，使用超薄切片机和金刚石刀切出50至80纳米的薄切片I。样品被切成薄片后，切片会漂浮在刀具的水浴面上，随后可将其捞取至常规透射电镜载网上。

现在可以使用常规的透射电镜技术对样品进行成像。此处展示的是利用高钾溶液刺激黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）分离的神经肌肉接头，并用FM 1-43对内化膜进行染色的结果。

可以使用常规的落射荧光显微镜观察神经末梢的荧光。在持续照明下，染料会完全漂白，当照明继续时，由于二氮杂苯沉淀而出现黑色。该神经末梢含有突触小泡，但其中没有一个发生光转化。

这可能是由于光照不足或DIA氨基苯在组织中渗透不良所致。相反，光照过强会导致整体终端过暗，无法分辨囊泡或细胞器；而在适当光照下，则可观察到相应的光转化现象。该显微照片显示了一个突触末梢，其中可见一群深色囊泡，表明发生了FM染料的光转化。

我们刚刚向您展示了如何对用fem die标记的突触小泡进行光转化。在执行此操作时，重要的是要始终仔细校准转化步骤的照射时间。就是这样。

感谢观看。祝您的实验顺利。