过敏性气道炎症期间肺树突状细胞成熟与迁移的分析

本实验的目的是评估小鼠在Val Boomin诱导的过敏性气道炎症过程中肺部树突状细胞（DC）的成熟与迁移情况。首先用Val Boomin对小鼠进行致敏，随后以荧光标记的Val Boomin进行气道激发。接着，采集肺组织和纵隔淋巴结。

最后，从肺组织和淋巴结组织制备单细胞悬液。最终，可通过流式细胞术分析在FITC Val Boomin刺激后纵隔淋巴结中找到的Pullman read树突状细胞的成熟状态及其绝对细胞数量。该方法有助于回答有关肺部免疫应答的关键问题，例如树突状细胞在抗原暴露后是否发生成熟，以及它们是否迁移至引流淋巴结。

如果它们发生迁移，还需确定其迁移速率。首先，在涡旋振荡条件下，将新配制的 Val Boomin 溶液以1:1的比例逐滴加入含有明矾的试管中。搅拌混合物30分钟，然后用0.2毫升该混合物填充一支1毫升的注射器。

用一只手的拇指和食指抓住待注射小鼠靠近颅底的颈背部皮肤。然后用另一只手将 Val Boomin 氢氧化铝溶液注入小鼠的腹腔内。第二次注射 Val 氢氧化铝溶液后第七天，将一只经 Val 氢氧化铝致敏并已麻醉的小鼠保持直立姿势，用无菌移液器吸头吸取 100 微升 freshly prepared val in fxi 溶液，逐滴滴加于小鼠的鼻腔（NAS）中。

首先，将一根20号导管连接到1毫升注射器上。然后，在确认小鼠已被安乐死后，从胸部一直切开至颈部，暴露并插管小鼠气管。灌洗肺部并灌注心脏至关重要，以确保清除外周血中所有污染的肺泡巨噬细胞和单个核细胞。

务必仔细进行接下来的两个步骤，当然，操作时手要稳。现在通过导管将含有EDTA的冰冻PBS注入下呼吸道三次，以冲洗下呼吸道并清除肺泡腔中的细胞。然后，取一支10毫升注射器并安装20号针头，经心脏右心室向肺部灌注10毫升含肝素的PBS。

当肺组织变白时，表明肺血管中残留的血细胞已完全清除。接下来，摘除纵隔淋巴结，并将其置于单独的培养皿中。为防止荧光淬灭，需尽量减少组织的光照暴露。

然后解剖灌注后的肺组织，将其置于培养皿中，并用剪刀将肺组织剪碎。接着，在37摄氏度下用每毫升250单位的胶原酶D消化肺组织。孵育25分钟后，向混合物中加入EDTA，作用5分钟以终止胶原酶活性。最后，将消化后的肺组织碎片通过100微米细胞滤筛过滤，并用低渗缓冲液裂解红细胞。

使用细针分离纵隔淋巴结，并用胶原酶进行消化（方法同前述肺组织），随后在腹腔注射、致敏和气道激发后，通过细胞筛过滤组织。可通过苏木精-伊红染色对对照组代表性肺组织切片中的炎性细胞存在情况进行评估。

经生理盐水处理的动物，其组织无炎症，如上方图示所示。相比之下，在致敏并激发的动物中，经瓦尔（Val）处理的肺组织切片中可见弥漫性炎性细胞浸润，如下方图示所示。下方图示显示，周期性酸-希夫染色（periodic acid shift stain）可用于评估黏液分泌情况。

在经瓦尔辛敏小鼠进行瓦尔激发后，气道过敏性炎症的诱导通过黏液的存在得以证实。相反，对照组则表现出完全无黏液产生。经生理盐水处理的小鼠如上方图示所示，在瓦尔激发后，肺部树突状细胞经历成熟并随后迁移至引流淋巴结。

此处对小鼠纵隔淋巴结的代表性分析显示，与生理盐水处理的小鼠相比，经Val Boomin致敏并激发的小鼠体内CD11c阳性细胞的比例出现虽轻微但持续的升高。此外，对致敏并激发小鼠纵隔淋巴结中CD11c阳性、CD11b阳性、Val Boomin FITC阳性细胞的绝对数量进行分析表明，与生理盐水处理组动物相比，激发组小鼠的树突状细胞（DC）数量升高了数倍。观看本视频后，我们应能充分理解用于分析肺部树突状细胞成熟及迁移的技术方法。

一旦你真正掌握了这项技术，便可进一步修改它，用于评估肺部树突状细胞对其他病原体以及其他实验因素的反应。