从大鼠脾细胞制备T细胞生长因子

大家好，我是Christine Beaton。我是加州大学欧文分校生理学与生物物理学系George Chen实验室的一名助理研究员。在接下来的两天里，我将向大家演示如何制备TCGF，即T细胞生长因子。

因此，在日常的细胞培养中，当我们不需要精确了解培养基中细胞因子的具体成分时，我们会使用T细胞生长因子（T-cell growth factor，TCGF），即来自脾细胞（splenocyte, spl CY）培养的S上清液，其中含有促进T细胞扩增所需的各类细胞因子。制备TCGF的方法是：处死健康的Lewis大鼠后，取出其脾脏，制备单细胞悬液，通过裂解法去除红细胞，然后用刀豆蛋白A（concanavalin A）刺激单个核细胞，从而诱导T细胞分泌其生长所需的所有细胞因子。为了生成TCGF，我们需要激活这些细胞。

因此，我们的操作方法是将凝集素刀豆蛋白A（concanavalin A，缩写为ConA）加入细胞培养物中。当我们将ConA加入细胞培养物时，它会结合到糖基化的T细胞受体复合物上，并同时结合多个复合物，从而引发我们称之为“成帽”（capping）的现象。这一过程将导致细胞表面的所有受体聚集在一起，形成受体簇，进而诱导T淋巴细胞产生激活信号。

因此，当细胞被激活后，它们将发生母细胞化，即细胞体积增大，随后开始分泌细胞因子。最初我们认为T细胞生长因子（TCGF）主要是白细胞介素-2，但现在我们已知事实并非如此。

其中还含有极少量的干扰素γ、TNFα以及可能存在的其他细胞因子，这些成分仅足以维持细胞在培养48小时后的存活。在培养过程中，细胞已产生我们所需的所有细胞因子。因此，接下来我们将去除细胞，当细胞被完全移除后，仅保留上清液，此时上清液中仍残留少量游离的刀豆蛋白A（concanavalin A），这会带来问题，因为我们希望利用T细胞生长因子来维持T细胞系的持续生长。

如果我们让伴刀豆球蛋白A（conval）在体系中游离存在，它会在我们不希望的时候激活细胞。为了解决这一问题，我们将加入过量的糖分子，使其与体系中所有游离的伴刀豆球蛋白A结合。这样，伴刀豆球蛋白A将被完全抑制，无法在我们向培养体系中添加TCGF时与细胞上的其他糖基化受体结合。

那么，我们开始吧。本实验的第一步是在大鼠安乐死后立即取出脾脏。接下来，我将使用无菌器械立即进行此操作。

取出脾脏后，我将把它们放入添加了抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）中，所用的抗生素为青霉素和链霉素。现在我们开始操作。首先，我用70%乙醇喷洒大鼠，以确保我的培养物不会受到任何污染。

然后使用我的器械，在此处皮肤上做一个小切口。接着，我移除一层肌肉，脾脏便暴露在此处。因此，我取用另一把镊子，轻柔地将脾脏拉出，避免造成损伤。

我像这样去除结缔组织。现在我得到了脾脏。当然，我非常小心，避免损伤腹腔内的其他任何组织，因为肠道一旦受损，将立即导致脾脏受到污染。

然后，我将脾脏转移至含有 PBS 加抗生素的离心管中，并将该离心管置于冰上保存。至此，我已从三只大鼠中采集了脾脏组织。

现在我们可以开始从这些脾脏中制备单细胞悬液了。我已经取到了脾脏，并将其转移至组织培养超净台中，准备使用70微米细胞滤网制备单细胞悬液。因此，我需要准备几样物品来完成脾脏单细胞悬液的制备。

我需要无菌的器械，包括一对手术镊和一把手术剪。然后将一支无菌的一毫升注射器的推杆放入培养皿中。我将把脾脏放入含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）中。

在另一个培养皿中，我放置了70微米的细胞筛网，并加入10毫升含抗生素的PBS。第一步是确保脾脏组织干净，因为如您所见，这里仍残留少量结缔组织，我将去除这些组织，因为它们会很快堵塞细胞筛网。为此，我只需将不需要的部分剪掉，并丢弃到培养皿的皿盖中。

现在我的脾脏组织已基本清理干净，接下来我将逐一取出脾脏，放入细胞筛中，将其剪成小块，并将三个脾脏的组织混合在一起。下一步是制备单细胞悬液。当然，为了确保无菌操作，我完全不触碰细胞筛，而是使用一支无菌1毫升注射器的推杆，将脾脏组织块通过细胞筛压滤。

如您在细胞分离器外部所见，我正在制备单细胞悬液。第一次研磨后，脾脏仍存在一些小块组织，但此时我已经开始收集单细胞悬液，并将其转移至一个预先置于冰上的50 mL离心管中。

我将用另外10毫升含抗生素的PBS重新填充我的细胞滤筛。因此，我大约再取10毫升含抗生素的PBS，无需非常精确，因为我们只是进行洗涤操作。将其加入细胞滤筛中，然后采用相同的步骤进行处理。

我回到注射器活塞处，继续稍微用力将组织通过滤网。当然，你不可能将所有组织都完全压过，因为结缔组织和一些我未能去除的小块脂肪会残留在细胞滤筛中。但你应该能将脾脏的大部分组织转移到细胞滤筛中。

然后我完全重复之前的操作步骤：收集我的单细胞悬液，并将其加入同一个牙齿中。此时，细胞筛中几乎已没有残留的筛上物，流出的 PBS 也变得清澈许多。我将再简单冲洗一次，此时应该已将大部分细胞洗出。

现在我已获得PLE细胞的单细胞悬液，接下来将对其进行离心，以便形成沉淀。离心8到10分钟即可。现在我们已经完成了PLE细胞的离心，得到了一个良好的沉淀。

接下来，我将去除上清液，然后裂解红细胞。因此，我将把细胞沉淀重悬于氯化铵溶液中。该溶液为0.15摩尔的氯化铵溶液，每只脾脏使用5毫升。

由于我有三个脾脏，我将使用15毫升氯化铵，并在冰上进行操作。为了裂解红细胞，我将轻轻吹打混匀3分钟。好的，我们将使用此处曝光度更高的图像。

现在我已经分析了电细胞三分钟。接下来，我将用 PBS 填满我的离心管，或者你也可以使用培养基。这样可使溶液的渗透压恢复到细胞的正常范围。

接下来，我将像之前一样以8到10分钟的时间离心细胞，使其沉淀。然后使用含有抗生素的相同PBS缓冲液洗涤细胞两次。现在，在电细胞解离后，我们已将细胞离心沉淀。请不必担心，电细胞的释放率从来不会达到百分之百。

因此，沉淀物仍呈红色，但上清液会更澄清。现在我将弃去上清液，重悬沉淀，加入PBS至50毫升，离心后重复该步骤一次，共洗涤两次。然后我就可以进行细胞计数了。我已经将心肌细胞洗涤了两次，随后将其重悬于培养基中，并使用细胞计数仪完成了计数。

结果符合预期。从三个脾脏中我获得了大约6亿个细胞，这是预料之中的，因为一个脾脏通常可提供2亿至2.5亿个细胞。接下来，我将把细胞接种到培养基中，接种密度为每毫升200万个细胞，培养基中已添加10%胎牛血清。

接下来，我将向该培养基中加入每毫升含2 µg的刀豆球蛋白A（concanavalin A），以刺激细胞。随后，我只需将细胞放入培养箱中培养48小时。目前细胞已在培养箱中培养了48小时，正如我将展示的，它们生长状况良好。

培养基已变为橙色。因此，我们现在可以完成TCGF的制备。如您所知，我已在细胞悬液中加入了ConA，以激活细胞。

因此，刀豆蛋白A（concanavalin A）是一种凝集素，它将结合T细胞上所有受体的糖分子，并人为地激活所有这些细胞。我们现在面临的问题是，细胞上清液中仍残留有一些刀豆蛋白A。

由于我们将在其他T细胞培养中使用snat来扩增细胞，因此我们不希望在这些细胞培养中存在con carnaval in a。为了去除它，我将添加过量的、能够与con naval in a结合的糖，即此处所示的甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷（methyl alpha D cyte）。我将加入过量的这种糖，并使其完全溶解。

它将结合所有剩余的浓缩氯化钠溶液。完成这一步后，我将对细胞上清液进行无菌过滤，并将等分试样冷冻保存，以备未来几周或数月内使用。现在我们开始最后一步操作。我将细胞培养上清液加入50 mL离心管中，以便离心去除细胞。

因此，我只需根据需要填充尽可能多的离心管，且我不在超净工作台内进行此操作，尽管我可以这样做。但由于最终我需要将溶液过滤，因为所添加的糖并非无菌，因此我直接在实验台上操作，这样更简便。现在，我已将所有细胞和上清液倒入50 mL离心管中。

接下来，我将把它们放入离心机，离心约10分钟。离心的唯一目的是使细胞沉淀成团，从而获得澄清的上清液。细胞现已完全沉淀，上清液变得澄清，这正是我需要收集的部分。

现在，我将把所有上清液收集到一个干净的150平方厘米的烧瓶中。然后，我将向该烧瓶中加入糖。在细胞离心的过程中，我已称取了足够的糖，使其添加量为每毫升上清液15毫克。

我将完全静置，让其彻底溶解，之后对上清液进行无菌过滤。现在，我要向上清液中加入糖，每毫升上清液加入15毫克。重新盖上瓶盖，由于我并未在无菌条件下操作，因此少量液体进入瓶盖也无影响，混匀直至所有糖完全溶解。

这应该相当快。是的，现在所有的糖都已溶解。接下来我只需对上清液进行无菌过滤，然后进行分装即可。

通常我会分装成 10 到 15 毫升的等分试样，保存在 -20 摄氏度。这样的等分试样可保存数月。你也可以将 TCGF 储存在冰箱中，但此时应在接下来的 10 到 15 天内使用完毕。

在过去两天里，我向您展示了如何制备T细胞生长因子，这种上清液制备方法非常简单，且成本低廉。因此，我们在实验室中经常使用它来维持T细胞系的培养，而无需购买昂贵的细胞因子混合物。祝您的实验顺利。