使用晶格光片显微镜四维可视化T细胞受体表面动力学

晶格光片显微镜是一种强大的成像技术，但世界上仅有少数实验室能够使用该技术。本方案详细介绍了如何使用 commercially available 晶格光片显微镜。这是一种极为强大的系统，能够对单个细胞或胚胎进行四维成像，从而实现对分子的实时追踪。

该技术的主要优势在于，它能够以高时空分辨率和最小的光漂白效应，对单个活细胞或器官进行三维成像。光片的晶格模式使我们能够高速地对样品进行成像，从而获得其他技术无法实现的、具有分子细节的三维活细胞和器官的实时视频。本视频协议首次展示了如何利用晶格光片显微镜对单个细胞进行四维成像。

由于涉及对齐和样品制备，该技术非常复杂。我们认为，通过视觉演示将提高技术的可及性，使更多科研人员能够对生物学中的多种分子、细胞和器官进行成像。开始此操作时，将直径5毫米的圆形盖玻片在室温下与0.1%多聚-L-赖氨酸孵育10分钟。

吸去液体，让盖玻片自然风干。接着，将三毫升密度梯度液加入一个15毫升的锥形管中。小心地将细胞逐滴加入管壁边缘。

在4°C条件下，以930 × g离心10分钟。随后，小心吸取完全培养基与密度梯度试剂之间的薄层中间细胞，注意将每种细胞类型分别收集至不同的锥形管中。以300 × g离心5分钟，洗涤细胞。

弃去上清液，向T细胞和CH27细胞的试管中各加入5毫升RPMI。用新鲜RPMI重复洗涤，直至总共完成三次洗涤。然后，将每支试管中的细胞重悬于1毫升完全RPMI培养基中，并用血细胞计数板对细胞进行计数。

将一百万个抗原呈递细胞重悬于500微升完全RPMI培养基中，并加入10微摩尔的MCC。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时。之后，将一百万个T细胞重悬于500微升完全RPMI培养基中。

加入两微克抗TCRβ Alexa 488标记的FAB片段，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。接着，将两种细胞在300 × g离心5分钟，弃去上清液。加入500 µL完全RPMI培养基，重复离心以洗涤细胞。

用新鲜的RPMI重复洗涤，直至完成总共三次洗涤，每次洗涤后弃去上清液。此后，将两种细胞重悬于500微升成像培养基中。首先，向LLSM浴槽中加入10毫升水和30微升荧光素。

按下“图像居中”以将物体移至成像位置，并观察单个贝塞尔激光束的图案。使用引导工具和预设的兴趣区域对准激光束，使光束呈现为在各个方向上均均衡的细条状图案。在寻像相机中，光束应显得聚焦清晰。

使用两个镜片倾斜调节器、顶部聚焦微米计和物镜颜色来调节光束。接下来，用至少200毫升的水清洗浴槽和物镜，以彻底去除所有荧光素。要对标准荧光微球进行成像，请通过在Xgalvo范围框中设置为3来开启抖动，然后按“Live”以查看当前视野。

手动调节倾斜镜、物镜颜色和聚焦微米计，以获得最高的灰度值。然后根据需要进行调整，以获取物镜扫描、Z 轴振镜、Z 轴加物镜以及样品扫描采集模式下的正确图像模式。完成上述步骤后，在样品扫描模式下点击“执行”，以采集样品点扩散函数，用于去倾斜和去卷积处理。

将激光切换至三色模式，然后再次点击执行。开始实验时，将100,000个抗原呈递细胞加入已准备好的直径为5毫米的圆形盖玻片上，静置10分钟使其沉降。在样品托上涂抹润滑脂，将盖玻片细胞面朝上放入样品托中。

接下来，在盖玻片背面加入一滴成像介质。将样品架旋紧到压电装置上，然后按下“图像归位”（Image Home）。找到一个需要成像的抗原呈递细胞，并确保线光片显微镜（LLSM）和成像软件正常工作。

按下“实时”以查看当前图像。沿Z轴移动以找到盖玻片和细胞。通过Z方向移动找到抗原呈递细胞的中心，然后按下“停止”以暂停激光。

检查3D并输入所需的设置。按下“居中”按钮，然后按下“执行”以采集数据。将载物台降至加载位置，以滴加方式在盖玻片上方直接加入50微升T细胞和成像培养基。

最好让移液器吸头末端形成一滴液体，然后将吸头接触浴液。单击“图像返回”将载物台复位，开始成像。

务必设置所需的Z轴层厚和延时成像时长。例如，以0.4微米的步长采集60层Z轴图像，并输入500个时间帧。在达到500帧之前停止记录，以避免光漂白。

使用实时模式搜索细胞对，当准备就绪并输入所需设置后，按“执行”以采集数据。本研究中，分离并制备小鼠原代5CC7 T细胞，随后使用晶格光片显微镜进行成像。此处显示的是使用荧光素成像时正确的光路和光束对准情况。

目标扫描应在XZ和YZ投影中显示一个尽可能对称的大X形，并且应调整至尽可能小的X形。Z轴振镜扫描应在XZ和XY方向上显示一个椭圆形，在两侧各有一个单独的点。

最后，Z轴增强目标扫描和样本扫描均应显示尽可能接近圆形的点。通过本方案，可观察到T细胞表面T细胞受体的四维动态。该显微镜的主要优势在于能够追踪可视化表面的T细胞受体单元，并获取其大小、运动、信号强度及分泌物的量化数据。

最重要的是要记住对准的质量。晶格光片显微镜必须每天进行对准，若未正确执行此步骤，将导致成像失真。同样，点扩散函数（PSF）采集的质量会直接影响去卷积的效果，最终决定最终图像的质量。

该方法如此强大的原因之一在于，每个细胞和标记均可被替换，从而可视化多种细胞类型和分子。因此，该方法可用于解答任何与分子四维追踪相关的问题。我们认为，该技术将为研究人员探索分子运输领域的全新问题铺平道路。

由于系统较为复杂，该技术目前尚未得到广泛应用，因此我们希望本 JoVE 视频能够提高该技术的可及性。系统所使用的激光器为四类激光，必须格外小心以确保激光安全。在使用本方法之前，请务必接受必要的激光安全培训。