从感染细胞的染色质中亲和纯化流感病毒核糖核蛋白复合物

Lyco 负链 RNA 病毒。流感病毒的基因组以病毒核糖核蛋白复合物（VR nps）的形式包装，其中单链基因组被核蛋白包裹，并与包含 PA、PB1 和 PB2 亚基的聚合酶复合物相关联。为从感染的哺乳动物细胞中纯化完整的复合物，将 Hela 细胞与重组的链霉亲和素标记的流感病毒共同孵育。

病毒进入细胞后，病毒感染后病毒RNA在细胞核内合成。通过去污剂裂解细胞，并利用基于离心和裂解的染色质分级分离方案，将细胞裂解物分离为胞质、核和染色质组分。最后，从各组分中亲和纯化带有Strept标签的病毒核糖核蛋白复合物（VRPs）。通过银染分析纯化的VRPs中蛋白质和RNA的组成表明，使用该方案可完整地分离即使紧密结合在染色质上的VRPs。因此，与传统的流感病毒核糖核蛋白复合物亲和纯化方法相比，本方案的主要优势之一在于：利用该方法能够从感染细胞的染色质中纯化VRPs，而染色质正是已知的流感病毒mRNA合成位点。

因此，我们的方法可用于解答有关病毒复制和转录调控的问题，例如，哪些病毒或宿主细胞因子，以及哪些翻译后修饰对于病毒mRNA合成或病毒基因组RNA合成是必需的。对于初次使用该方法的研究人员而言，可能会遇到一些困难，因为亚核分馏对生化条件非常敏感，且在不同细胞系之间可能存在显著差异。本实验方案开始时，使用感染了流感病毒RWSN PB2 Strep的细胞，该病毒的PB2亚基C末端通过基因工程融合了Strep标签，感染复数为3。

用预冷的 PBS 洗涤细胞一次，然后加入 12 毫升预冷的 PBS 并从培养皿中刮下细胞。使用橡胶刮刀将细胞转移至 50 毫升锥形管中，通过离心形成细胞沉淀。

该实验步骤中最困难的部分是细胞分馏方案。细胞核对匀浆和混匀操作极为敏感，若操作不当，极易破坏染色质提取物。因此，不仅需要严格遵循匀浆技术，还必须注意如本实验所示的裂解液的一般处理方式。

离心去上清后，用 PBS 和 Resus 将细胞沉淀重悬于 10 毫升预冷的蔗糖缓冲液中。将 200 微升移液器吸头连接至 10 毫升塑料血清移液管，使细胞悬液通过该吸头以破碎细胞团块。将细胞悬液置于冰上孵育 10 分钟。

定期轻轻倒置细胞以重新悬浮细胞。接着，加入NP-40至终浓度为0.5%，立即高速涡旋15秒，随后在台式离心机中于4°C、3,500 × g条件下离心10分钟。离心后，弃去上清液，并将其转移至15毫升锥形管中。

将上清液在 4°C 下保存。此为细胞质组分。与原始细胞沉淀相比，沉淀物应更小且颜色更白，如此处所示。

如果该实验方案将在稍后完成，请将细胞沉淀保存在 4 摄氏度条件下。否则，继续用 5 毫升冷蔗糖缓冲液洗涤沉淀，并按之前步骤进行离心。离心结束后，弃去上清液，将含有细胞核的沉淀重悬于 1.5 毫升冷核浆提取缓冲液中。

将重悬的沉淀转移至预冷的4毫升全玻璃Dounce匀浆器中（配备严丝合缝的研杵），用20次上下抽吸进行匀浆。操作时避免产生泡沫，大约在10次抽吸后阻力应逐渐增加。为确认匀浆充分，需在相差显微镜下检查样品。

细胞核不应再呈圆形，而应呈现不规则形态，看起来似乎已经破裂。待细胞核完全匀浆后，将其转移至1.5毫升微量离心管中。将匀浆液置于4°C的旋转摇床上孵育20分钟。

然后在4°C条件下，以16,000 × g在微量离心机中离心10分钟。离心后，将上清液（即核浆组分）转移至1.5毫升离心管中，并在4°C下保存。随后，将沉淀重悬于1.5毫升预热至37°C的消化缓冲液中。

然后在37摄氏度下孵育该组分10分钟。接着加入42微升5摩尔的氯化钠，使氯化钠的终浓度达到150毫摩尔，然后在冰上孵育20分钟。在4摄氏度下，以16,000 × g 的速度在微量离心机中离心10分钟。

离心后，移除上清液，并在 4°C 下保存。此为 CH 150 组分。用 1.5 毫升预冷的高盐缓冲液重悬沉淀，冰上孵育 20 分钟。

在4°C条件下，使用微量离心机以16,000 × g离心10分钟。离心后，弃去上清液，并将其在4°C下保存。此为CH 500组分。

取出分步分离实验过程中保存的各组分，置于冰上。向胞质组分中加入 300 微升 5 摩尔的氯化钠。然后将每份组分中 100 微升紧密沉淀的 Strep T 偶联 Sphero 磁珠转移至 15 毫升锥形管中。

向珠子中加入10倍体积的链霉亲和素洗涤缓冲液。倒置离心管以混匀，然后在台式离心机中以1000 × g离心5分钟，弃去上清液。

用缓冲液重复洗涤两次，然后加入与沉淀体积相等的Strep洗涤缓冲液重悬沉淀，再向每份样品中加入200微升经洗涤的Strep Actin磁珠悬液。在4°C条件下旋转孵育1小时。随后在4°C、1000 × g条件下离心1分钟，弃去上清液。

然后向15毫升离心管中与胞质组分孵育的磁珠加入1毫升洗涤缓冲液。加入洗涤缓冲液后，将磁珠转移至1.5毫升离心管中。洗涤磁珠1分钟，随后在4°C条件下以1000 × g离心1分钟。

在最后一次洗涤步骤后重复两次。使用平头吸头彻底去除洗涤缓冲液的残留。然后加入100微升洗脱缓冲液，轻轻混匀，并将试管置于冰上孵育15分钟。

孵育期间，偶尔通过轻轻敲击管底混匀珠子。15 分钟后，在 4°C 条件下以 1000 × g 离心 1 分钟。收集含有洗脱的 Strep 标签 VRP 的上清。

他，我们的细胞感染了流感病毒株WSN达九小时，裂解物经分步提取后，通过蛋白质印迹法进行分析，结果如图所示。温和的细胞核分离方法能有效提取细胞质蛋白（如微管蛋白），同时避免大量核蛋白的释放。请注意，用低盐缓冲液提取的染色质组分富含对转录重要的蛋白质。

尽管高盐组分主要含有核小体，但为了确定洗脱的细胞质组分的蛋白质组成，对感染未标记病毒、RWSN 或 RWSN PB2 Strep 的 HeLa 细胞在感染 9 小时后所得的 V NPS 进行了银染分析，结果如细胞质洗脱液所示。此处 NP 相对于 PA、PB1 和 PB2 的比例较高，这由 55 千道尔顿以上的主要条带与 95 至 100 千道尔顿之间的条带对比得以证明，表明大部分 Strep-PB2 作为完整形成的 vRNP 的一部分被纯化，换句话说，捕获的可溶性聚合酶极少。在感染 9 小时后，通过银染显示，使用 RWSN PB2 Strep 或 RWSN 感染所纯化的 vRNP 可以从所有四个细胞组分中获得。

病毒核糖核蛋白复合物（v RMPs）的最高浓度存在于核质中，尽管也可从细胞质和染色质中纯化出相当数量的复合物。观看本视频后，您应能够充分理解如何从感染细胞的细胞核中高效纯化出完整的流感病毒核糖核蛋白复合物。在执行该实验流程时，务必注意使用洁净的缓冲液，并避免将样品不必要地暴露于室温环境中，以防止RNA和蛋白质降解，以及避免蛋白质复合物的解离。

此外，请勿忘记操作具有传染性的流感病毒可能存在危险。在裂解液中加入 NP 40 之前，所有步骤均应在生物安全二级工作台内进行。