利用代谢标记与流式细胞术测量细胞周期进程动力学

以下实验方案的总体目标是测量细胞周期的动力学及其进程。首先，用溴脱氧尿苷（BrdU）对细胞进行脉冲-追踪标记，BrdU在DNA合成过程中被整合到细胞DNA中以替代胸苷。随后，使用抗BrdU抗体对细胞进行免疫染色，并在染色后立即通过流式细胞术进行分析。

只有处于S期的细胞才会被标记，随着标记细胞在细胞周期中进展至G2期，在有丝分裂完成后，这些细胞被检测出具有4N的DNA含量。随后，DNA含量减少至2N。因此，通过流式细胞术获得的荧光图谱分析可用于确定细胞周期进程的动力学特征。

与使用化学试剂进行细胞同步的其他方案相比，该技术的主要优势在于不会对细胞产生生理干扰，从而避免意外影响细胞分裂机制。我们最初采用该方法是由于在尝试利用化学同步手段研究细胞周期进程速率时，得到了干扰分析结果的意外数据。该方法有助于回答细胞生物学领域中的一些关键问题。

例如，不同类型细胞之间生长速率差异的基础是什么？通过使用BrdU对细胞进行脉冲-追踪标记来启动本实验方案。首先，为每个时间点各准备一个10厘米培养皿，此外每个对照组也各需准备一个培养皿。

仅使用BRDU，仅使用PI，BRDU阴性，PI阴性，每块培养板接种五乘以十的五次方个MCF7细胞于添加补剂的DMEM培养基中，将培养板孵育24至48小时，使细胞恢复并贴壁。当细胞融合度达到60%时，更换为含有10微摩尔的全新DMEM培养基。

将细胞在37摄氏度、5% CO2条件下用BRDU孵育一小时，以使BRDU掺入DNA中。确保留出一块未处理的培养板作为阴性对照或一小时后的零时间点。移除脉冲标记培养基，并用PBS对两到八小时时间点的细胞进行短暂冲洗。

加入新鲜的培养基，然后将培养皿放回培养箱中。接着，立即按照下一节所述方法收获零小时和一小时时间点的培养皿。收获细胞时，吸除培养基，并用缓冲液清洗培养皿。

先用 PBS 洗涤一次，然后用胰蛋白酶处理细胞以使其从培养板上脱落，并用 DMEM 培养基收集细胞，在 390 ×g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液。随后用 1 至 5 毫升冰浴 PBS 重悬细胞，在 390 ×g 条件下离心 5 分钟，离心后弃去上清液，并将细胞重悬于 100 微升冰浴中。

含1% FBS的冷PBS。FBS有助于防止细胞聚集。该操作最关键的步骤之一是确保从收获的细胞中获得单细胞悬液。

为了达到这一目的，可以逐滴将细胞直接加入乙醇中。接下来，为固定细胞，需使用移液器将细胞逐滴加入5 mL冰冻的乙醇中。

将70%乙醇加入15毫升离心管中。将细胞在冰上孵育30分钟，或在4°C下过夜保存。这是停止收集不同时间点样本的理想步骤，样本可在乙醇中保存数天，以便后续统一进行BRDU和碘化丙啶染色的其余操作步骤。

从四摄氏度取出细胞，以 390 ×g 离心五分钟。离心后吸除大部分固定液，留下约 50 微升。然后涡旋振荡。

涡旋振荡以松散沉淀，使DNA变性。逐滴缓慢加入1 mL 2 N HCl-Triton X-100，然后在室温下孵育样品30分钟。以390 × g离心5分钟使细胞沉淀，随后吸除并弃去上清液。

然后将细胞沉淀重悬于1毫升0.1摩尔的四硼酸钠溶液中。离心后，再次吸去并弃去上清液。随后将细胞沉淀重悬于75微升BRDU染色液中。

混合后于室温避光孵育45分钟。孵育结束后，通过离心沉淀细胞，方法同前，然后将细胞沉淀重悬于1毫升含5微克/毫升碘化丙啶的PBS中。运行PI阳性样本时，通过流式细胞仪绘制前向散射与侧向散射图，以确认细胞大小分布的正确性。

这两个参数均应以线性刻度绘制。同时查看FL3-H与FL2-W的散点图，以观察PI染色与荧光脉冲宽度的关系。该图用于设门，以分离出被认为处于细胞周期正常分布模式的细胞群体。

通常，该分布模式的特征是出现两个细胞簇，分别代表 PI 染色后具有二倍体（2N）和四倍体（4N）DNA 含量的细胞，对应于细胞周期中的 G1 期和 G2 期。位于这两个细胞簇之间的成串细胞代表正在进行 DNA 复制的 S 期细胞。创建一个散点图，以 Y 轴为对数尺度显示门控细胞的 FL1-H 或 FITC 信号，X 轴为线性尺度显示 PI 信号。

该图将用于通过各种控件设置其余参数以及收集数据。进行分析时，将仅含PI染料的样本放入流式细胞仪的上样口，调节增益使G1峰位于x轴约200处。在PI染料的直方图中，这将更易于观察。

接下来将仅含BRDU的样本放入上样孔并运行。调节增益，使细胞的两个群体——BRDU阳性与BRDU阴性——在图中清晰显现。理想情况下，BRDU阴性细胞应位于10¹处或略低于该位置。

最后一个对照是 BDU/PI 阴性样品。运行此阴性对照以确保细胞不出现于任何上方或右侧象限中。在设置好各图的参数后，对流式细胞仪进行校准，即可用于处理 BrdU 和 PI 染色的细胞。每个样品至少采集 10,000 个经 PI 门控的细胞的数据。

然后使用 FlowJo 或 FACS Diva 等软件，以 PI 与 FL 双参数图中圈选的 PI 阳性细胞为基础，绘制 FITC 与 PI 的散点图，以区分增殖周期中的细胞群体。接下来，设置第二个圈门以分离 BRDU 阳性细胞群体。

然后，通过绘制含有G1期或G2期DNA含量的BrdU阳性细胞数量随时间变化的曲线，以比较两种结直肠癌细胞系HT 29和LS 180的细胞周期进展动力学。在撤除BrdU脉冲后，每小时收集一次细胞，持续八小时。

比较两条曲线的动力学特征，可见在 LS 180 细胞中，加入 BRDU 后 4 小时出现明显的 G1 期峰，而 HT-29 细胞系在相应时间点则无此峰。这表明 LS 180 细胞的细胞周期进程在细胞周期的 G2 期加快。在结直肠癌细胞系 LS 180 中生成乳腺癌细胞系的周期分布曲线。

MC七细胞在去除BrdU脉冲后，每小时收集一次，持续八小时。随后根据其荧光信号对免疫标记及DNA复染的细胞进行分选。

如图所示，CF7细胞的增殖速度明显慢于所测试的两种结直肠癌细胞系中的任何一种。观看本视频后，您应能充分理解如何通过DNA代谢标记结合时间点收获的方法，来追踪细胞周期动力学。