使用四种技术测量人类精子细胞内 Ca²⁺ 的变化：常规荧光测定法、停流荧光测定法、流式细胞术和单细胞成像

本实验的总体目标是利用荧光染料检测人精子细胞内钙离子浓度的动态变化。首先通过上游法制备精子样本，并在需要时诱导精子获能；第二步是将钙离子荧光染料负载到精子细胞内。

接下来，使用常规荧光光度法、停流荧光光度法、流式细胞术或单细胞成像技术进行实验，并记录钙离子信号的测量结果。最终，通过分析结果来确定由孕酮诱导或在获能过程中触发的细胞内钙离子浓度变化。与放射性标记等现有方法相比，该技术的主要优势在于具有很高的灵敏度。

该方法操作安全且简便。此方法有助于回答表面等离子共振（SPR）钙信号研究领域中的关键问题，例如高空间和时间分辨率下鉴定可诱导细胞内钙升高的化合物，以及鉴定西门子样品中不同的细胞亚群。例如，采用流式细胞术的技术意义可延伸至通过分析雄性配子的生理状态来诊断生育问题。

尽管该方法可为人类精子钙离子动员的研究提供见解，但也适用于其他类型的细胞，例如来自其他物种的雄性配子，或神经元、肌细胞等不同类型的细胞。通常情况下，使用该方法的研究人员会面临困难，因为精子操作并不容易，且在整个实验过程中维持适当的条件以获得具有活力和运动能力的细胞至关重要。我们通过结合不同领域的策略，实现了这些技术的应用。

该方法的可视化演示非常重要，因为样品的制备与处理以及化合物的添加过程较难掌握：精子细胞在操作过程中容易受损，且在化合物添加时可能产生反应假象。制备精子样品时，需将1毫升F-10培养基小心地铺加到每500微升液化精液的上方。使用移液器时，应将枪头轻触离心管管壁，并缓慢将培养基加在样品上方。

必须缓慢操作，以避免样品层与培养基层混合。培养基中添加了2毫摩尔的氯化钙和每毫升5毫克的牛血清白蛋白（BSA）。为促进体外获能，小心将试管倾斜至大约30度角。

这将增加两种液体之间的表面积，从而在孵育过程中促进精子细胞从样本向培养基的迁移或上浮。接下来，将倾斜的试管放入孵育箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳和95%空气条件下孵育一小时。

使用微量移液器小心地从每根试管中移除上层700微升含活动精子的Hams F-10培养基。将所有收集的样品汇集到一根洁净的玻璃试管中，避免产生气泡。取10微升混合样品置于血细胞计数板底座的光学平玻璃上，然后盖上盖玻片。

务必避免计数室内产生气泡，否则会导致细胞计数不准确。使用配备20倍物镜的复式显微镜进行观察。黄斑计数室的盖玻片上有一个大方格，由100个小方格组成。

计数任意一条10个方格区域中的细胞数量。该数值代表每毫升中的细胞浓度（以百万个细胞计）。在另外两条10个方格区域内重复计数，并计算三次计数结果的平均值，以用于加载荧光染料的细胞。

在1.5毫升离心管中，加入所需体积的精子悬液，并加入适量的1毫摩尔Fluo-3 AM储备液（终浓度为2微摩尔），混匀后于37摄氏度避光孵育30分钟。以750 ×g离心5分钟。若离心后形成云雾状沉淀而非紧密沉淀，表明细胞状态良好。吸除并弃去上清液，将沉淀用适当体积的人类精子培养基（HSM）重新悬浮。开始实验时，在平底玻璃管中加入570微升HSM和30微升先前负载了Fluo-3 AM并重新悬浮于HSM中的精子细胞悬液，使细胞浓度达到每毫升1×10⁸个细胞。

将磁力搅拌子放入玻璃试管中，并将试管插入已预热至37摄氏度的分光光度计检测室。在数据采集期间，样品必须持续搅拌。使用oli软件启动实验，并以0.5赫兹的频率连续采集300秒的荧光值。

在获取30秒的基础荧光信号后，使用Hamilton微量注射器在100秒时注入适当体积的待测化合物，本例中为微摩尔浓度的孕酮。在20微摩尔浓度下使用离子霉素作为阳性对照，以获得最大荧光值。本实验以高时间分辨率检测细胞内钙离子的变化。

使用与快速动力学光学系统联用的 SFM 20 停流混合器，将一毫升含荧光标记的精子细胞加入仪器的一个注射器中，另一个注射器中加入一毫升待测化合物（20 微摩尔孕酮溶于 HSM 中）。

在此示例中，将液体吸入注射器时必须避免产生气泡。将两个仪器的活塞提起，直至其接触到注射器推杆的末端。为尽量减少细胞损伤，将总采样时间设置为 50 秒，频率设置为 10 毫秒，并将流速设置为能够产生可测量响应触发信号的最小值。

试剂混合后，原始荧光随时间变化的曲线将显示在计算机屏幕上。在进行流式细胞术之前，重复此步骤，用HSM替代孕酮作为阴性对照，并以10微摩尔离子霉素作为阳性对照。通过在每根流式管中加入500微升细胞悬液，按不同实验条件分别制备待测样品。

使用仪器配套软件设置实验。首先，创建一个新的文件夹、实验样本以及试管数量。然后为 flu O 3:00 AM 选择合适的流式细胞仪参数设置，使用异硫氰酸荧光素和碘化丙啶滤光片。

在流式细胞仪上运行未染色的对照管一和对照管二。收集前向散射光和侧向散射光数据，以验证阈值设置是否合适，并建立相应的设门，用于区分细胞碎片与细胞。运行实验管，并从每个样本中收集10,000个事件的荧光数据。

最后，将所有数据导出至可用的分析软件中。通过在每张圆形盖玻片的中央滴加5 µL多聚-L-赖氨酸溶液，制备本实验所需的圆形盖玻片。

使用前至少静置一小时，然后用水冲洗处理区域。这将去除多余的多聚赖氨酸，并使精子细胞头部贴附在盖玻片上，同时其鞭毛仍可自由活动。将盖玻片组装到记录室中。

将浓度为每毫升1 × 10⁷个细胞的Fluoh 3:00 AM标记细胞10微升，置于盖玻片中央。用200微升预热的HSM覆盖细胞。

将培养 chamber 置于预热至 37 摄氏度的显微镜载物台上，使用相差显微镜观察细胞。选择细胞密度适合成像的区域。细胞密度过高会导致信号重叠，从而增加分析难度。

细胞应以其头部牢固地附着在盖玻片上，同时表现出鞭毛运动，以此确认其活性。通过启动时间序列图像采集软件开始实验。通常每秒需要采集四幅图像，每幅图像的照明时间为2毫秒。

在活细胞模式下采集荧光图像，调整焦距和亮度。使用微量移液器小心地逐滴加入待测化合物（本例中为孕酮），并根据需要继续进行图像采集。

在同一反应池中依次进行两次对照添加：加入20 µM离子霉素以获得最大荧光信号，再加入5 mM氯化锰以获得最小荧光信号。使用IQ软件离线进行图像分析。

围绕每个细胞或细胞的某一部分绘制感兴趣区域（ROI）。此外，选择一个无细胞区域，以便软件进行自动背景扣除。随后，每个ROI将获得一个时间荧光强度序列，这些数据可导出至Microsoft Excel进行进一步分析。

黄体酮是已知的顶体反应诱导剂之一，正如预期的那样，通过传统的荧光测定法测量发现，它可引发人精子细胞内钙离子浓度出现短暂升高。红色荧光信号随时间的变化显示了加入4微摩尔黄体酮后细胞内钙离子浓度的改变；作为阴性对照，加入了HSM，其并未引起细胞内钙离子浓度的变化，如蓝色荧光信号所示；每条曲线均展示了加入10微摩尔离子霉素所引发的变化。

加入该钙离子载体可导致RA细胞内钙浓度升至最高水平，且无法恢复至基础水平。该柱状图显示了各实验条件下荧光变化量（ΔF）的平均值，误差线表示标准误，N=3；星号表示与对照组相比，P值小于0.001。通过停流荧光测定法对孕酮诱导的细胞内钙浓度升高进行了更高时间分辨率的测量，此处展示了代表性结果。

原始信号如图A所示，红色曲线代表的孕酮和蓝色曲线代表的离子霉素均引起细胞内钙离子浓度迅速升高。绿色曲线为阴性对照，其中细胞与HSM混合。图B显示了通过从相应原始信号中减去对照信号而获得的、经校正的孕酮或离子霉素诱导的信号曲线。

孕酮引起细胞内钙浓度非常快速且短暂的升高，荧光值在加入诱导剂后2.7秒达到峰值。另一方面，CIN在整个50秒内引起细胞内钙浓度快速且持续的升高。图B插图显示了每种反应最初500毫秒的扩展视图。

黄体酮诱导的细胞内钙浓度升高无延迟现象，这与先前报道一致，表明黄体酮可直接激活钙通道catSper，无需中间信号转导。还使用流式细胞术检测了获能和未获能人精子中的细胞内钙浓度。这些是代表性的前向散射和侧向散射图。

已获能的细胞显示为蓝色，未获能的细胞显示为红色。选定的门控区域由蓝线标出，仅该区域内的细胞被用于后续分析。图B显示了未染色精子在Fitzy通道中的荧光直方图，图D显示了在凌晨3:00经Fluoh 3:00 AM染色的精子在FZ通道中的荧光直方图，如图D所示。代表已获能精子的蓝色曲线所显示的荧光值分布较代表未获能精子的红色曲线向更高荧光值方向偏移。

图C显示了未染色细胞在PI通道中的荧光直方图，图E显示了死细胞在PI通道中的荧光直方图。每个单个细胞的荧光值可以在下方所示的二维荧光点图中观察到。对于未染色细胞以及用Fluoh 3:00 AM和PI双重染色的细胞，每个象限中记录的细胞百分比由红色数字标示。

重要的是，可以消除来自死细胞的信号。最后，通过成像这些代表性伪彩图像，测量了单个精子细胞中由孕酮诱导的胞内钙离子浓度变化，这些图像显示了细胞在加入孕酮、CIN 和氯化锰前后的状态。加入孕酮会导致精子头部和尾部的胞内钙离子浓度升高，而氯化锰用于降低荧光信号。

本图展示了实验中九个单个细胞的代表性归一化荧光轨迹在凌晨3:00时因淬灭而产生的荧光情况。与群体实验中观察到的结果一致，单细胞分析显示，黄体酮诱导的荧光呈短暂性升高，而离子霉素诱导的荧光则呈持续性升高。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三至四小时内完成。

在尝试本实验操作时，重要的是要记住验证细胞的活性，并在操作后进行适当的对照实验。在本方法建立之后，还可采用其他方法（如电生理学技术）来回答更多问题，例如通过使用特定溶液和刺激方案，鉴定参与钙离子升高的特异性离子通道。该技术为细胞生理学领域的研究人员探索活细胞内钙离子动态变化提供了途径，具有高空间和时间分辨率。

观看本视频后，您应能够充分理解如何根据拟回答的具体科学问题，针对任何类型的细胞，选择最合适的荧光染料技术来检测细胞内钙离子浓度的升高。请务必注意，处理人精液样本可能存在生物安全风险，因此在操作过程中必须采取预防措施，例如使用经确认健康供体的样本、在实验过程中佩戴乳胶手套，并对使用过的溶液和材料进行妥善处置。