绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列

本实验的目的是研究细菌基因与通路之间的功能关系。首先制备大肠杆菌（E. coli）单基因突变株的阵列，这些菌株将进行接合或交配。第二步是在平板上以阵列形式将单突变株进行接合。

接下来，筛选双突变体。最后一步是成像双突变体平板并量化双突变体菌落，以确定菌株的适应性。最终，通过分析菌落大小数据来计算遗传相互作用评分，并鉴定功能上相互关联的基因、通路和生物学过程。

与现有的随机诱变等方法相比，该技术的主要优势在于能够构建大量独立的双突变菌株。此外，无论基因大小、必需性或单基因突变体的适合度如何，均可同时评估多个基因之间的相互作用。该方法有助于回答系统生物学领域中的关键科学问题，例如与基因功能以及不同通路和生物过程之间功能串扰相关的问题。

该技术的应用前景涉及细菌感染的治疗，因为了解功能上最核心的基因和过程，以及明确哪些细菌基因、通路和过程的组合在受到扰动时会增强或削弱细菌的适应性，将有助于开发最有效的干预策略。本实验方案开始时，采用两步嵌套 PCR 扩增法，按照书面操作步骤所述，利用 PKD3 质粒中的氯霉素抗性标记替换目标开放阅读框。

根据制造商的说明书确认预期产物，并对获得的片段进行PCR纯化。将PCR产物洗脱于30微升无菌蒸馏水中后，稀释至浓度约为50毫克每微升。纯化后的产物在转化前保存于负20摄氏度。

接下来，为供体构建制备高频重组（HFR）Cavalli 感受态细胞。首先将 1 毫升过夜培养的 HFR Cavalli 菌株饱和培养物接种到含有 35 微升 50 毫克/毫升氨苄青霉素的 70 毫升新鲜 LB 培养基中，置于 250 毫升锥形瓶内。

将培养物在32摄氏度下以220转/分钟（RPM）轻轻振荡培养，直至获得约0.5至0.6的光密度值。随后将培养物转移至42摄氏度的水浴中，以160转/分钟（RPM）振荡进行15分钟热诱导，以启动λ Red同源重组系统，然后停止诱导。再将培养物转移至预冷的冰水浴中，在160转/分钟（RPM）条件下继续振荡10至20分钟。

确保在转化前保持细胞处于低温状态。按照书面实验方案所述，通过离心洗涤并收集细胞后，倒掉上清液，并将细胞沉淀重悬于500 µL冰上预冷的含10%甘油的Eloqua溶液中。将细胞分装成每管50 µL，加入预先冰预冷的1.5 mL微量离心管中，并立即进行转化。

向感受态细胞中加入 100 纳克纯化的基因敲除盒。轻弹离心管，使悬浮液在冰上静置 5 分钟。然后将悬浮液转移至预冷的电穿孔管中，立即进行电穿孔操作。

加入1毫升室温的SOC培养基，将电穿孔后的细胞转移至15毫升培养管中。在32°C下以220转/分钟的转速振荡培养1小时。培养结束后，在4,400 ×g离心5分钟。

在室温下，移除约 850 微升上清液，并将细胞沉淀重悬于剩余液体中。将细胞涂布于含有 17 微克/毫升氯霉素的 LB 平板上，于 32 摄氏度过夜培养。次日，挑取两个独立的转化子在 LB 氯霉素平板上划线，以确认突变体；同时将相同的转化子在 LB 卡那霉素平板上划线，以确认菌株不具有卡那霉素抗性。

接下来，按照书面实验方案，使用三组不同的敲除验证引物对DNA进行扩增。第一组引物包含一个位于靶向区域上游200个碱基处的20个核苷酸长的侧翼正向引物，以及一个与氯霉素抗性盒互补的反向引物。该扩增预期产生一个445个核苷酸长的扩增片段。

第二组包括一个正向引物，该引物与氯霉素抗性盒序列的起始端结合，以及一个反向侧翼确认引物，该引物设计在目标基因3'端缺失区域下游约200个碱基处。该扩增反应预期产生一个长度为309个核苷酸的扩增片段。第三轮PCR则同时包含上游和下游侧翼引物。

该反应旨在确认所选菌株并非骨髓二倍体，即一个基因位点被盒式结构取代而另一个位点发生重复，但其余部分仍保留野生型基因拷贝的情况。该扩增预期产生一条1.4 KB的产物。大肠杆菌Keio单个非必需基因缺失突变体文库通过机器人复制点样至24块384孔板中。

将每孔含有80 µL液体LB培养基的微孔板中添加50 µg/mL卡那霉素，以容纳边界对照菌株，该菌株缺失作为阳性对照，并有助于平板标准化以及自动菌落定量。移除每块平板最外侧孔中的接种培养基，并将其转移至新平板，使最外侧孔保持空置。

同样，通过从每块平板的不同位置移除任意两种菌株，并将这些菌株转移至新平板，来制备阴性对照点。接着，用含有 17 µg/mL 氯霉素的 LV 培养基填充所有空孔，包括边缘对照孔和阴性对照孔。这些阴性对照点在受体菌和双突变平板中应为空白。

它们用于确保在对成像板编号或点样时未出现处理或操作误差。按照书面步骤制备边缘阳性菌株后，将阵列菌株以及边缘阳性菌株在32°C、190 RPM振荡条件下过夜培养，次日将过夜培养物约80 µL加入边缘孔中。组装好的微孔板可用于后续部分所述的交配实验。

或者，对于长期保存，向受体板的每个孔中加入15%甘油，并混合培养基和甘油。然后将平板储存在负80摄氏度条件下。开始接合实验前，将携带待研究基因缺失并以氯霉素抗性盒标记的HFR供体菌株在含有17微克/毫升氯霉素的丰富LB液体培养基中，于32摄氏度过夜培养。

将TH订购的受体突变体文库以每板3 × 84菌落密度点种于固体LB平板上，LB平板中添加50微克/毫升的卡那霉素。同时，将供体查询突变菌株以每板3 × 84菌落密度平行点种于相同数量的LB平板上。

加入终浓度为 17 微克/毫升的氯霉素。将平板在 32 摄氏度下孵育过夜以实现菌株接合。将来自 3 个 84 菌落的过夜培养供体菌接种至固体 LB 平板上。

然后将单个384菌落的受体菌株点接到新鲜点接的供体菌株上方。将点接好的接合板在32摄氏度下培养16至24小时。接着，将每个384密度的接合板点接到含氯霉素的单个固体LB平板上。

并且可以重复使用美尼西林进行此过程，直到所有接合板均已被点样？将新点样的第一轮筛选板在32摄氏度下培养16至36小时。培养后，将每块第一轮筛选板以1536点阵格式重新点样至第二轮双药物筛选板上，使每个第一轮筛选菌落对应四个菌落。

在第二轮筛选平板上，将平板培养 16 至 36 小时。在 32 摄氏度下孵育后，对最终的双突变体筛选平板进行拍照，以定量测量突变体的生长适合度，并分析基因对之间的相互作用。由于同一通路中的基因表现出高度相关的遗传相互作用（GI）模式，因此可根据其 S 分数谱的整体相似性，通过聚类方法将功能相关的基因归为一组。

GI谱相似性反映了两个基因发生突变后表型的一致性，可用于指示这两个基因是否作用于相同或重叠的通路。此处展示的是编码物理相互作用蛋白的基因对与随机选取的基因对之间GI谱相关系数的分布情况。此外，还展示了一个散点图示例，显示了两个形成异源三聚体复合物（该复合物为精子排出所必需）的转运蛋白之间高度相关的遗传谱，其表现类似于酵母大肠杆菌基因的表现。

具有高度相关遗传相互作用（GI）谱的缓解性相互作用往往编码在物理上相关联或在共同的生化通路中协同作用的通路。此处展示了一个代表性示例：功能冗余的ISC和SUF铁硫簇生物合成通路的组分共同参与一个必需过程，各自形成独立的簇，并通过大量加剧性相互作用相互连接。可采用统计学方法来检测特定通路组合之间相互作用的显著富集情况，并将GI网络与物理相互作用及其他功能关联数据（如基因组上下文）进行整合分析。

关系可以揭示定义细菌核心生物系统的高阶功能模块的组织方式。聚类分析也可应用于基因相互作用网络，以预测已注释基因的功能。由于聚类算法各不相同。

然而，通过聚类分析确定的潜在功能注释需要独立的实验验证。在尝试执行该流程时，务必注意包含所有必要的阳性与阴性对照。此外，还可开展蛋白质组学、生物化学后续实验以及化学基因组学等方法，以回答有关特定基因功能以及基因与通路之间功能关系性质的进一步问题。

观看本视频后，您应能充分掌握如何构建双突变菌株、组装受体阵列，以及在大肠杆菌中开展ESGA筛选，以研究基因与生物过程之间的功能关系。