人胰岛染色方案

本实验的总体目标是通过苏木精和伊红染色以及免疫组织化学方法对人体胰腺胰岛进行表征。该目标通过制备包埋于石蜡块中的胰腺样本的连续切片来实现。随后，将这些切片按原始方向置于载玻片上。

部分切片使用伊红-苏木精染色，其余切片则通过免疫组织化学法染色，最后一步是扫描染色后的切片并按病例进行归类。最终，这些图像可上传至在线病理学数据库，供本领域的其他研究人员查看。该技术相较于现有方法的主要优势在于，切片在染色过程中能够以系列形式进行，同时保持其原始方向。

本次操作演示由本实验室的组织技术员 Linda Snyder、生物科学家 Emily Montgomery 和实验室技术员 Tiffany Hippo 进行。首先，按照石蜡切片的标准操作程序设置水浴锅和切片机。随后，使用载玻片标记笔在带正电荷的载玻片上标注病例编号、胰腺区域和玻片编号。

所有准备工作完成后，将石蜡包埋块放入切片机夹具中，使包埋盒标签位于左侧。按照常规切片程序切片，直至组织均匀暴露。当组织切面均匀一致时，连续切下厚度约为四微米的带状连续切片。

根据所需的初始染色数量，需要三到六个切片。接下来，将切片带中的各切片分开。按顺序逐个拾取每个切片，并将其放置在载玻片上。

用铅笔记录切片编号。若某个切片无法使用，则跳过该编号，并按确切顺序继续对后续切片进行编号。将切片放置于载玻片上时，须保持其在包埋盒中原有的方向，并使载玻片标签位于左侧。

接下来，将切片放入切片架中，室温下过夜晾干。在室温下，用一层薄薄的石蜡重新封固石蜡块表面，以保存组织，并将石蜡块在室温或-20摄氏度条件下存档。对下一个样品重复此操作步骤。

对于连续切片的编号，每个层级都应保持如上所述的H和E染色顺序。将每个组织块的第一张切片放入载玻片架中，然后将玻片架放入自动染色机的第一个染色槽内。选择标准的HE染色程序并启动染色过程。

染色完成后，将载玻片从自动染色机中取出，放入通风橱内进行封片。采用标准技术在每张载玻片上加盖盖玻片。最后，使用打印标签标记载玻片，并在通风橱中充分干燥。

首先设置自动染色机并准备所有必要的试剂。选择用于双重染色的Daco程序。输入玻片数量及每张玻片将接受的处理方案。

根据制造商的建议将所有试剂加入自动染色机中。接着，配制本实验步骤所需的TBST和柠檬酸缓冲液、抗体及其他试剂。将切片放入二甲苯中孵育5分钟以脱蜡。

切勿让玻片干燥，否则在脱蜡过程中会导致背景染色过强和孔隙染色。使用前将柠檬酸缓冲液倒入蒸锅中预热。随后，将脱蜡后的玻片依次进行系列乙醇洗涤。

用去离子水将玻片再冲洗一次。将玻片放入预热的柠檬酸盐缓冲液中，蒸汽处理30分钟。处理结束后，立即将玻片转移至室温水浴中，直至完全冷却。

冷却后，将切片转移至Dayco自动染色机的染色架上，并注意保持正确的顺序。最后，运行之前加载的双重染色程序；程序完成后，从自动染色机中取出切片，在脱水前使其干燥至少一小时。

为继续脱水，将切片转移至80%乙醇中浸泡一分钟。随后将切片浸入95%乙醇，再进入100%乙醇中完成脱水。最后，将切片浸入二甲苯中并保持一分钟。

立即使用细胞封片剂（cyto seal）和盖玻片封固载玻片，以完成该操作步骤。打印包含病例信息的标签，内容包括器官名称、组织块编号、染色类型及日期。在每张载玻片上粘贴标签，以便扫描染色切片。

将它们放置在扫描仪托盘上，并遵循标准操作流程。将染色切片在室温下存档，剩余未染色切片于-20摄氏度保存以备后续使用。最后，按供体及所见组织类型对染色图像进行归类整理。

以下是低倍和高倍放大下KI 67与胰岛素染色的示例。染色后的胰腺切片图像被提交至在线病理学数据库，从而建立一个虚拟生物样本库。利用该数据库，研究人员可以快速获取开展研究及1型糖尿病相关工作所需的信息。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备和染色高质量的人胰腺组织切片。