改进的人类胰岛手术标本激光显微切割操作方案

您好，我叫Dorte，来自理工大学Thea Hands研究所，Reen Laser。显微切割是一种技术，能够从极少量的原发肿瘤组织中获取特定的细胞群体。所分离的细胞可用于转录组学和蛋白质组学研究、DNA检测或染色体分析。

本文提供了从手术标本中获取人胰腺间质细胞用于转录组学研究的实验方案。将胰腺组织切成小块。取一块置于冷冻模具中央，并用预冷的包埋剂覆盖。

立即用预冷的两种材料包埋组织，并在零下80摄氏度保存。将40张防脱片贴上标签，并置于冷冻切片机冷室中预冷。修整冷冻组织块后，使用OCT包埋剂将冷冻组织固定在样品托上。

切取40片10微米厚的切片。通过用手指触碰载玻片背面，仅加热放置切片的位置，将一片切片转移至一张载玻片上。将切片在冷冻切片机内干燥2至3分钟，随后于-80摄氏度保存。准备染色试剂，并将除硒以外的所有液体置于冰上预冷。这将增强显微切割前组织细胞的内在自发荧光。

每次将有四个切片被降级处理。每次操作两个切片。首先将其在70%乙醇中固定30秒。

然后用蒸馏水快速浸洗切片5到6次。之后将组织在100%乙醇中脱水1分钟，并重复此步骤一次，再将载玻片置于二甲苯中孵育4分钟。

同时，开始对另一对切片进行脱水。最后，在避光条件下将载玻片风干三到五分钟。将两张载玻片背对背放入铝箔包裹的50 ml离心管中，以保护组织免受潮气影响，并防止自发荧光淬灭。在切片前，用RNAs away清洁显微镜，并将粘性帽固定到robo Mover上。

将载玻片插入载物台，并将盖玻片轻轻移至切片上方，但不要接触切片。通过识别自体荧光较强的贝塔细胞区域来定位眼状结构。在该设置下，人贝塔细胞的内在自体荧光呈黄色，而胰腺导管则显示明亮的绿色自体荧光。

使用套索选择工具选取较佳的细胞区域，并通过启动激光进行显微切割。在40至60分钟内，将四个已降级的冷冻切片上的小孔切割并收集到同一个粘附帽中。如需要，可将收集组织后的帽移至显微镜的检测点，以检查所捕获的组织。

取下 robo mover 的盖子，向盖内加入 10 µL 裂解缓冲液以裂解细胞。将盖子倒置，在 42 °C 下孵育 30 分钟。

离心裂解液，标记离心管，并于-80 °C保存，直至进行RNA提取。对全部40个冷冻切片进行激光显微切割及裂解操作。随后，合并10份裂解液，按照UR PU RNA提取试剂盒提供的说明书继续进行RNA提取，以获得11 µL RNA。

总体而言，我们未发现显微切割组织量与RNA得率之间存在直接关系。外科医生取材后至病理医生检查胰腺标本完毕并进行冷冻保存之间的时间间隔差异，可能部分解释所获得RNA的质量和数量差异。其他需要考虑的关键因素包括用于显微切割的激光能量——较低的激光能量有助于获得更高的RNA完整性，以及激光聚焦和激光压力切割点的位置。此外，通过尽量缩短粘附帽与组织之间的距离，可进一步优化RNA的得量。

在具备激光显微切割显微镜的条件下，应避免在捕获过程中丢失显微解剖组织。该方法可在任何开展部分胰腺切除术的研究机构中实施，从而增加获取来自非糖尿病和糖尿病受试者的人眼睑组织材料的机会。