芯片上内皮炎症表型分析

本视频的目的是演示一种用于表征内皮细胞炎症状态的芯片实验室技术。首先，将人主动脉内皮细胞在组织培养基质上培养至融合，然后将其插入锥板剪切装置（Conan板剪切装置）中。细胞用促炎性细胞因子TNF alpha处理，同时通过精确控制基质上方锥体的旋转，在四小时内施加不同的剪切应力条件。剪切应力可调节细胞对细胞因子的特征明确的炎症反应。

这包括黏附分子（如 VCA 1 和 ICAM 1）的上调。将基底转移至显微镜载物台上，其中 A-P-D-M-S 微流控装置通过真空直接密封到单层细胞上，形成流动通道。将活化的单核样 THP-1 细胞流经预处理的 hs，其结合量与细胞黏附分子表达水平成正比。

通过定量牢固黏附的 THP-1 细胞总数来确定内皮细胞的炎症状态。大家好，我是 She D Diverse，我是 Greg Foster，我是 Keith Bailey。

我们位于加利福尼亚大学戴维斯分校生物医学工程系的教授、Pastor 和 Simon 的实验室。今天我们将介绍一种基于芯片实验室技术的方法，用于定量研究内皮功能障碍和炎症反应。这些工具为我们提供了研究代谢应激与流体动力学因素叠加作用的平台，可用于探讨内皮炎症表型的调控机制及其对动脉粥样硬化的易感性。

因此，我们将我们的设备称为血管模拟微流控腔室，或 VMMC。这些设备使我们能够在模拟动脉粥样硬化血管环境的条件下，定量分析内皮细胞和单核细胞的炎症反应。VMMC 能够减少试剂或材料的使用量，适用于供应有限的情况。

它们还可以以多种可定制的布局和几何结构构建，使其非常适用于广泛的应用场景。今天我们将演示一个采用芯片实验室方法的代表性实验。在明确定义的剪切应力条件下，对人血管内皮单层细胞进行细胞因子激活。

我们将演示如何利用VMC实时定量人单核细胞向单层内皮细胞的募集，以此作为内皮细胞活化的功能性读数，所用的三英寸圆形基底由100毫米细胞培养皿经车床加工而成。将三英寸基底用蒸馏水清洗后，通过浸泡于70%乙醇中进行灭菌。无菌基底置于100毫米培养皿中晾干。

然后在室温下用浓度为100微克/毫升的I型胶原孵育一小时，并用PBS洗涤。人主动脉内皮细胞（HAEC）或HA以每毫升65万个细胞的浓度悬浮。取1毫升细胞悬液以滴加方式置于干燥的胶原包被基质上，并铺展成均匀的悬液。

将已固定的基底置于37°C、5% CO₂的培养箱中，使其附着于基底表面。一小时后，加入9 mL EGM-2生长培养基，细胞继续培养至形成单层，融合度约为90%。此时单层细胞可用于后续的剪切力实验。通过将A-P-D-M-S模具浇注在包含目标微通道几何结构的主模上，制备血管模拟微流控腔室。

将硅胶基础剂倒入塑料模具船中，再按10:1的重量比加入硅胶固化剂。随后充分混合PDMS凝胶，注意不要刮擦模具船的内壁，以免将塑料碎屑混入混合物中。光刻胶母模使用己烷清洗，并准备用于VMMC的 molding。

然后将PDMS混合物倒入模具上，再放入真空室中。在真空室内，PDMS混合物中的空气在15分钟后被去除并上升至表面。

将模具从腔室中取出，并轻轻向PDMS表面吹气，以清除模具中残留的气泡。然后将模具盖好，放入37°C的烘箱中反应一小时，使PDMS固化。将固化的PDMS凝胶从烘箱中取出，使用小型解剖刀在腔室周围进行环形切口。

必须逐步进行此操作，以避免接触光刻胶材料，否则会损坏母模。使用19号鲁尔锁针从模具中切下每个通道的微流控腔室的入口和出口。此外，在远离通道的位置为真空管打孔。

男性包皮环切术（VMMC）的准备工作现已完成。将促炎性细胞因子TNF alpha用移液器加入6毫升L 15培养基中，以达到0.5纳克/毫升的终浓度。此处使用L 15培养基作为剪切液，因其在无5% CO2条件下具有pH缓冲能力。

然后将培养基吸入一支无菌的10毫升注射器中，用于加载剪切装置。接着将融合的单层细胞转移至细胞剪切装置中，该装置已用乙醇灭菌并调平，且锥形间隙高度已设定。将基质从培养皿中取出，置于玻璃量块上居中，并小心地插入腔室底部，使锥形部分正对细胞上方。

通过均匀拧紧围绕量块分布的不锈钢螺丝来固定基底。然后将剪切介质装入腔室，注意避免引入任何气泡。接下来，使用计算机输入所需的剪切应力程序，并启动微型分离电机。

此处我们采用0 ± 5 达因/平方厘米的振荡剪切力。四小时后，停止剪切程序。移除量规块，并将基质小心地放回培养皿中。

细胞现已准备好用于单核细胞黏附实验。剪切处理后的人脐静脉内皮细胞单层立即被转移至显微镜工作站，以组装血管壁流动腔室（VMMC）。将VMMC连接至真空泵软管，并浸入去离子水中，以去除通道内可能滞留的任何气泡。

首先关闭真空阀，将腔室小心地压在单层细胞上，然后打开真空阀。此时必须确保腔室通道内没有困住气泡。接着，用剪去尖端的19号鲁尔锁针制作一个储液槽，向其中加入80 µL含钙和镁的HBSS溶液。通过用力按压储液槽顶部将液体从尖端推出，然后将其插入VMMC的进样口。

将整个装置放置在显微镜载物台上，并打开显微镜相机和视频监视器。将一个10毫升玻璃注射器安装到注射泵上。接着，将注射器的管路连接至VMMC的出口端口。

设定流速以在通道内产生每平方厘米一达因的剪切应力，然后以补充模式运行，使注射器通过通道从储液池中抽取液体。经SDF-1刺激的T淋巴细胞悬液浓度为每毫升200万个细胞。在启动流动后的两分钟内，向储液池中加入50微升细胞悬液。

再次注意，在完全形成流动时避免引入气泡。视频以每秒三帧的速度采集，数据使用 Image J 软件进行量化。黏附的 THP-1 细胞定义为在 10 秒内移动不超过半个细胞直径。

在此，我们展示了一组数据，描述了在肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激下，THP-1细胞黏附于人主动脉内皮（HA）单层细胞的情况，这些单层细胞分别在15 dynes/cm²的稳定高壁面剪切应力或±5 dynes/cm²的振荡剪切应力条件下进行培养。与经历高剪切应力的单层细胞相比，经历振荡剪切应力的HA单层细胞对THP-1细胞的募集增加了三倍。今天，我们演示了可定制的体外技术的应用，这些技术可结合使用，以深入揭示动脉粥样硬化早期炎症事件的机制。具体而言，我们在明确定义的流体动力学条件下，量化了内皮功能障碍以及细胞在炎症刺激下所表现出的相关生物学效应。

使用VMM CS可使我们研究内皮细胞与白细胞黏附相互作用背后的特定机制。这些装置还具有灵活、成本低廉的优势，并有助于使用供应有限的材料，例如来源于人类受试者的血清成分。我们应用这些装置开展的研究包括对内皮细胞中由细胞因子、脂质和RAGE诱导的炎症反应的探究。

我们还开发了芯片上的检测方法，用于研究多种白细胞类型以及全血中的黏附机制。最终，我们设想该技术将推动针对个体炎症介导的心血管疾病风险的体外评估方法的发展。