基于吞噬动力轨迹运动测定法对细胞迁移的定量评估

本实验的总体目标是利用基于金纳米颗粒的细胞运动性检测方法，实现对细胞运动性随时间变化的定量测量。该目标首先通过制备用于包被金纳米颗粒的玻璃盖玻片来实现。具体而言，无内毒素的盖玻片先用明胶包被，然后进行烘烤。

第二步是还原氯金酸，从而生成金纳米颗粒，并将该溶液均匀地涂覆在明胶包被的盖玻片上。接下来，将细胞放置于带有金纳米颗粒涂层的盖玻片上，根据实验所需的时间进行孵育。随后，明胶会置换金纳米颗粒，形成轨迹。

最后一步是利用显微镜对移动细胞形成的轨迹进行成像，以监测和定量细胞运动性。最终通过免费提供的软件对轨迹面积进行测量。该技术相较于现有方法（如延时成像）的一个主要优势在于，本实验仅需使用标准的光学显微镜、标准相机，并采用免费的图像分析软件。

此外，该检测方法还可通过具备高通量筛选能力的实验流程，简便地实现对多个样本的分析与比较。尽管该方法可用于研究不同生理因素和细胞运动的影响，也可应用于其他系统，例如研究病原体对感染细胞运动能力的影响。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为本方法要求严格遵循实验方案中规定的体积和温度条件。

本方案中，重点在于评估沉淀的金纳米颗粒最终溶液的颜色，以确保实验成功。该方法的视觉演示至关重要，因为FGO动力学轨迹运动测定步骤较难掌握。

它们包含一些在细胞和分子生物学实验室中不常用的实验步骤。制备明胶包被的盖玻片时，首先将明胶溶于去离子水中，配制成终浓度为每300毫升含0.5克的溶液，然后将混合液高压灭菌15至30分钟。需要注意的是，明胶加入后应在组织培养超净台中两小时内完成此操作。

将8至9个经酸洗的盖玻片转移至一个100毫米的塑料培养皿中，以准备包被。确保盖玻片彼此不接触，也不与培养皿的侧壁接触。小心地在每个盖玻片上滴加2至3滴明胶，避免液体溢出到培养皿表面。

然后将含有明胶包被盖玻片的培养皿放入烘箱，在90摄氏度下烘烤10分钟。10分钟后，从烘箱中取出培养皿，并将其放回组织培养超净台中。

轻轻吸去多余的明胶。将培养皿放回烘箱，在70摄氏度下干燥盖玻片45分钟。待盖玻片干燥后，从烘箱中取出培养皿，并放回组织培养超净台中。

使用无菌的细针轻轻挑起盖玻片的一侧，然后用无菌镊子将涂有明胶的盖玻片从培养皿中取出，并放入24孔板的各个孔中。下一步是制备胶体金涂层的盖玻片。

首先，在组织培养罩内准备 10 毫升 0.5% 枸橼酸钠溶液：将 1.5 毫升 14.5 毫摩尔的氯金酸溶液与 13.5 毫升经高压灭菌的去离子水加入无菌、无内毒素的锥形瓶中。每处理八到九个盖玻片，应得到淡黄色溶液。氯金酸具有毒性，操作时应小心谨慎。此外，该试剂对光敏感，因此煮沸步骤应在避光条件下进行。

当溶液达到沸点时，将烧瓶从加热板上取下，并转移至搅拌器上。为了在溶液中形成胶体金颗粒，需在搅拌条件下，每15毫升氯金酸溶液加入0.7毫升0.5%的柠檬酸钠溶液，继续搅拌约两分钟。在此期间，溶液颜色将由浅黄色变为无色，再由灰色变为紫色，最终变为深紫色。

最终呈现深红色或更理想的铁锈色之前，用一支10毫升移液管吸取胶体金溶液，并让溶液在移液管中静置冷却一至两分钟，直至达到室温。然后，将0.5至1毫升溶液滴加到24孔板中涂有明胶的盖玻片表面。将含有胶体金覆盖的盖玻片的24孔板放入37摄氏度的培养箱中，孵育30分钟。待颗粒充分沉降到明胶涂层的盖玻片上后，在光学显微镜下检查其密度。

金纳米颗粒的适当分布有助于简便高效地识别太阳能小车的边缘。最佳密度随细胞大小而变化。金颗粒密度过高会阻碍细胞运动，而密度过低则限制对细胞运动轨迹的准确勾画。

因此，在单个实验中，只能使用同一批次或经测定具有相同密度的盖玻片。如果金颗粒的浓度过低，可向明胶包被的盖玻片中额外加入0.5至1毫升胶体金溶液。然而，如果金颗粒浓度过高（如此处所示情况），唯一有效的选择是重新制备胶体金溶液，并包被新的盖玻片。

如果颗粒密度合适，将培养板放回 37 摄氏度的培养箱中，孵育一小时至过夜，然后通过将盖玻片在无菌磷酸盐缓冲液中浸洗三次，以洗去未结合的金颗粒。随后将胶体金包被的盖玻片保存在装有 PBS 的洁净 12 孔板的孔中，置于 4 摄氏度，直至使用。盖玻片不得干燥，且应在制备后两至三个月内使用。

下一步是为细胞培养准备胶体金包被的盖玻片。首先将盖玻片放入24孔板的各个孔中，每个孔预先加入约0.3毫升培养基。然后将大约5,000至50,000个细胞接种到每张胶体金包被的盖玻片上。细胞数量因细胞类型而异，但细胞密度必须足够低，以防止同一区域多个细胞的运动轨迹相互重叠。

用盖子盖住培养板，置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育6至24小时。根据细胞类型的运动能力，应通过实验确定每种细胞类型的最适孵育时间。孵育结束后，对于不立即分析的盖玻片，应先将其在磷酸盐缓冲液中浸入两次，随后在室温下用3%多聚甲醛孵育15分钟以固定。使用光学显微镜对未固定或已固定的盖玻片上单个移动细胞形成的轨迹进行成像。拍摄细胞轨迹图像时所用的放大倍数因细胞类型而异，但同一项研究中必须使用相同的放大倍数，以便结果具有可比性。

对于单核细胞，使用免费提供的软件（如 Image、NIH Image 或 Image Tool），采用 40 倍放大倍数可取得良好效果，通过分析此处所示捕获图像，可确定每个样本中 10 至 20 个或更多细胞清除的胶体金平均面积。图中显示的是单个未受刺激的单核细胞在 40 倍物镜下所清除的胶体金颗粒路径。非运动性细胞在其周围形成典型的小椭圆形或圆形轨迹，表明其运动水平较低。相比之下，高运动性细胞则表现出方向性运动，轨迹呈拉长状，且总体面积更大，形状不规则。

最好使用 Image J 软件中的手绘工具勾画细胞轨迹的轮廓，以分析其体积。随后可利用 Image J 分析菜单中的测量工具进行定量面积测量。在进行该操作时，必须严格遵循实验方案中指定的体积和温度，因为任何偏差都可能显著影响最终结果。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备明胶包被的盖玻片、如何制备金纳米颗粒及其包被的盖玻片，以及如何利用光学显微镜监测并定量评估细胞运动。

请注意，在电热板上操作沸点溶液时，特别是氟化物、AIC酸和柠檬酸钠沸点溶液产生的蒸气可能具有危害性，因此进行该实验操作时，必须采取在通风橱内操作并运用基本安全常识等预防措施。