利用基于细胞的ELISA检测法对HIV-1三聚体包膜糖蛋白进行构象评估

以下实验的总体目标是利用单克隆抗体检测RIC HIV-1包膜糖蛋白（ENV）的构象状态。首先转染贴壁细胞，使其在细胞表面表达嵌合型HIV-1 ENV蛋白；第二步，将细胞与抗ENV单克隆抗体孵育，抗体将根据表位暴露情况与ENV结合。

接下来，加入HRP标记的二抗，通过化学发光检测法来定量抗体的结合情况。根据每份样品获得的相对光单位，可得到VNV结合抗体的相对水平。该技术相较于现有方法（如基于流式细胞术的分型）的主要优势在于，仅需少量抗体即可实现高通量操作，本实验将由实验室的一名博士后完成该技术操作。

在转染前一天，将人成骨肉瘤细胞以每孔2×10⁴个细胞的密度接种于适合进行发光检测的不透光96孔细胞培养板中。使用添加了胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM培养基，在37°C及5%二氧化碳条件下培养过夜，次日进行后续实验。

配制转染混合物。首先，准备两支试管，将两份A液和两份B液分别加入两支试管中。每管加入5微升DMEM培养基（添加25毫摩尔HEPES），随后加入10纳克tat和包膜质粒，以及150纳克编码嵌合型HIV-1包膜糖蛋白的质粒。

请注意，只有在使用依赖 TAT 的 HIV-1 包膜糖蛋白编码质粒时，才需要 TAT 编码质粒，将其与 5 微升 DMM 和 450 纳克聚乙烯亚胺（PEI）混合。试剂和 DNA 的用量应根据需转染相同 HIV-1 包膜糖蛋白的孔数进行调整。接下来，将 B 管中的内容物加入到另一个 2 mL 离心管中，并通过涡旋振荡 10 秒充分混匀。

将转染混合物在室温下孵育10分钟。10分钟后，向96孔板的每孔中加入10微升转染混合物，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育48小时。在人骨肉瘤细胞转染后两天进行Ali SA实验，以研究单克隆抗体对嵌合型HIV-1包膜糖蛋白的识别。

每块同时使用的培养板准备 250 毫升洗涤缓冲液。通过向洗涤缓冲液中加入 1% 脱脂干牛奶和 5 毫摩尔 Tris（pH 8.0），为每块培养板准备 125 毫升封闭缓冲液。从 96 孔板中移除细胞培养基和转染混合物。

每孔加入 100 微升封闭缓冲液，室温孵育 20 分钟。室温下移除上清液，每孔加入 50 微升用封闭缓冲液稀释至适当浓度的抗体，室温孵育 1 小时。

用 100 微升封闭缓冲液洗涤三次，然后重复洗涤过程三次。用 100 微升封闭缓冲液洗涤三次，最后一次洗涤后，再用 100 微升洗涤缓冲液洗涤三次。移除样本。

加入100 µL封闭缓冲液，室温孵育5分钟。室温下移除上清液，加入50 µL用封闭缓冲液按1:3000比例稀释的二抗。室温孵育40分钟，孵育时间40分钟后结束。

用100微升封闭缓冲液洗涤三次，随后用100微升洗涤缓冲液洗涤三次。为准备样品进行数据采集，从96孔板中移除上清液，并向每孔加入30微升一倍浓度的增强型化学发光底物。在合适的酶标仪上，对每孔采集1秒的化学发光信号。

根据制造商的说明，可溶性 CD4（sCD4）对包膜糖蛋白（ENV）上 CD4i 表位暴露的影响通过检测 CD4 与 ENV 的相互作用进行评估。CD4 与 ENV 的结合会诱导 ENV 发生构象变化，从而暴露与共受体结合位点重叠的 17B 和 48D 表位，但不影响识别外结构域的抗体 2G12。为了评估 NV 构象中单点突变的影响，使用了两种 ENV 突变体：H66A（其自发采样 CD4 结合构象的倾向降低）和 S375W（其使 NV 更倾向于处于 CD4 结合状态）。将原始数据根据表达水平进行归一化后发现，H66A 会减弱 CD4i 17B 的识别，而 S375W 则增强 17B 信号，并足以恢复 H66A 的表型。

通过共转染不同量的CD4表达质粒，对突变体进行细胞检测。NV蓝色柱状图显示，针对CD4的单克隆抗体A32和C11的信号逐渐增强，这两种抗体可识别ENV糖蛋白内结构域中的非连续性表位。而2G12抗体对gp120 ENV的识别未受影响。

最后，将原始数据归一化至两个 G12；当 ENV 与一种 CD4 突变体共转染时，32 和 C11 的调制消失，表明信号增强依赖于 ENV 与 CD4 的相互作用。一旦掌握，该技术可在四小时内完成。