利用BLT人源化小鼠作为基于干细胞的基因治疗肿瘤模型

以下实验的总体目标是生成携带经人工改造的人类免疫系统的小鼠。该目标的实现首先需要准备小鼠以进行手术，第二步是将一段胸腺组织装入套管针中。将Matrigel与CD34阴性及CD34阳性转导细胞混合，然后将该混合物加入套管针中。

接下来，将 Matrigel 构建体移植到肾包膜下。最终，可通过活体 PET 成像和实体肿瘤测量来监测经基因工程改造的 CD8 T 细胞对靶向肿瘤的排斥反应。该技术相较于现有方法（如完全免疫缺陷小鼠模型）的主要优势在于，能够研究基因修饰的人干细胞在人胸腺内的发育过程，并对所衍生的细胞谱系进行后续体内功效验证。演示本实验操作的人员为我们实验室的三名技术人员：Gregory Bristol、Bernard Levin 和 Sean Kim。

在此示意图中，概述了本研究中用于生成嵌合小鼠的改良BLT模型，这些小鼠携带特定的T细胞。胸腺类器官由来自自体胎儿肝脏分离的经转导与未经转导的CD34细胞重建而成。部分经转导的细胞被冻存，并在四至六周后注射到经照射的小鼠体内。

在本视频中，当动物因麻醉而变得迟钝后，将演示第三次活体构建物的植入过程。首先，剃除每只小鼠从背部中线至腹部之间、从髋部到肩部的左侧体表毛发。在记录每只动物体重后，通过耳部打孔编号，并在每只小鼠的肩部皮下注射0.3毫升卡洛芬。

然后将小鼠向右侧卧，头朝左。用 PBS 冲洗带有圆锉尖端的 16 号癌症移植针的套管。使用一对尖头镊子，将一块胸腺组织放入 PBS 培养皿中，然后水平持握套管及推杆。

在尖端内部吸取组织。将套管针滑入肾包膜下方并注射组织是该操作中最困难的步骤之一。接下来，请一位助手协助。

使用带滤芯的正向置换移液器，将5 µL冷的基质胶轻轻混入一管细胞中。保持套管水平，助手缓慢回抽活塞的同时，另一人用移液器加入基质胶。

为每只小鼠将试剂混入套管针中。首先，用碘伏擦拭动物的裸露皮肤，然后用异丙醇擦拭巾擦去碘伏。通过两次观察确定皮下颜色最深的位置，以指示脾脏所在部位。

使用钝头镊子提起肾脏上方的皮肤，可在脾脏背侧约5毫米处找到肾脏。沿脾脏平行方向在皮肤上做一个长约15毫米的切口。在下方的腹膜肌肉层做类似的切口。

在雄性小鼠中，肾脏应可直接可见。只需挤压腹部即可使其突出。在雌性小鼠中，先用左手持续按压腹部以保持肾脏暴露，然后使用止血钳夹住卵巢，再将肾脏拉出，以帮助维持该器官处于体外。

在肾被膜的后端轻轻戳一个小孔，然后将套管针插入此孔并沿肾脏推进，直至套管针的开口完全被肾被膜覆盖。接着用右手小指注射组织。随后使用闭合的止血钳轻轻将肾脏推回原位。

用双结在腹膜上缝合一针，将皮肤像束口袋一样向上收拢，然后使用两个伤口夹固定。最后，向每只眼睛滴加一滴 PBS，并将小鼠侧卧放置在铺有垫料的笼子中。以相同方式完成所有小鼠的植入后，在离开前确认动物已恢复腹部朝下的体位。

此第一张图展示了人源化小鼠中 THI 活体移植的代表性图像。该图显示了胸腺组织的正常发育以及人源 CD4 和 CD8 阳性 T 细胞的生理性组织分布。在完成重建后，动物体内具有人类免疫系统，并呈现出正常的 CD4 和 CD8 阳性 T 细胞分布。

此处显示了一只携带黑色素瘤的小鼠的代表性图像。灰色区域表示CT扫描图像，彩色区域表示PET扫描检测到的肿瘤代谢活性。

本实验中，仅CT扫描显示白色圆圈所示区域存在一个较大的肿瘤团块。然而，活体PET成像表明该区域主要由坏死组织和瘢痕组织构成，突显了PET成像在评估肿瘤退缩和清除方面具有更高的敏感性和准确性。在完成该操作后，可进一步开展T细胞检测、表型分析及离体激活等其他检测，以回答与T细胞功能相关的问题。