用于研究靶向微血管系统的细菌感染的人源化小鼠模型

本实验的总体目标是研究脑膜炎奈瑟菌在体内感染人血管的机制。首先将人皮肤移植到免疫缺陷小鼠体内，从而引入人真皮血管；第二步，用该细菌感染人源化小鼠，以实现上述研究目标。

随后，让感染按照预定的时间段继续发展。最后一步是采集血液和组织样本，以评估感染的结果。最终，通过结合组织学、免疫荧光以及血液和组织分析，来研究感染在人体血管中的进展过程。

与现有的细胞培养模型或动物模型等技术相比，该技术的主要优势在于，我们首次能够观察到这些感染过程中典型的临床病理变化。在样本采集后应尽快用70%乙醇清洁人皮肤表面，然后将其平铺在洁净的表面上，最好在通风橱内操作。接下来，使用预设好厚度的皮片机从皮肤顶部切下200至400微米厚的切片。

检查切片的完整性，然后将其进一步修剪为 2 厘米 × 2 厘米的方块。将方块放入 PBS 中，随后用 70% 乙醇清洁已进行手术准备并麻醉的 6 至 8 周龄重度联合免疫缺陷 beige 小鼠的去毛区域。在移植部位局部麻醉后，使用弯头剪刀小心地去除略小于移植物大小区域的表层皮肤，注意不要破坏下方的血管系统。

为避免移植物干燥，迅速操作，将一片人皮肤覆盖于移植床上，确保表皮面朝上。对齐组织边缘，并用组织胶固定。然后小心地将人皮肤的其余部分贴合到移植床上，在每一边缘周围涂抹少量组织胶。

始终修剪人体皮肤至合适大小，而不是扩大移植床。确认每个角固定后，用碘溶液清洁该区域，并将创可贴的垫层一侧覆盖在移植物上，牢固但不过紧地贴合，注意不要影响动物的呼吸，然后用敷料胶带固定创可贴，并将动物置于温暖的表面上使其恢复。待动物清醒后，将其放回笼中，直至细菌注射前将过夜平板培养物重新接种至液体培养基中。

感染当天早晨，当细菌达到所需浓度时，将细胞稀释至每毫升含一乘以十的七次方个菌落形成单位。然后对小鼠进行麻醉，通过脚趾夹捏法确认移植小鼠的镇静状态，并将其放置于加热垫上。

将眼药膏涂抹于动物的眼睛上，然后进行腹腔注射。每只小鼠注射八毫克溶于生理盐水的人转铁蛋白。随后，剪取每只动物尾尖，将尾部的一小滴血液涂布于琼脂平板上，以确认感染前血液无菌。

然后通过眶后注射，将100微升细菌培养物静脉注射。数分钟后，再次剪取尾尖，将该血液样本也涂布于新鲜的琼脂平板上。为确定感染后即刻的血液菌落形成单位，用组织胶封闭尾部伤口，同时将细菌接种液进行梯度稀释，并涂布于含适当抗生素的琼脂平板上。

为了确定感染后6小时的接种菌落形成单位，需再次从小鼠尾部采集少量血液，然后将血滴进行稀释并接种培养，方法如前所述，以确定6小时时的菌落形成单位。随后将所有培养皿置于37°C、5%二氧化碳条件下过夜培养，以进行器官菌落形成。对感染动物进行菌落形成单位计数。

首先对每只安乐死的小鼠进行正中切口。然后对每只动物切开肋骨，并在心脏上做一切口。使用无菌注射器从心脏和胸腔中尽可能抽取血液，并将血液分别注入各自的无菌管中用于各样本。

接下来，取出目标器官，然后将皮肤移植物及相应的小鼠皮肤部分逐个转移至无菌培养皿中，每只动物使用一个培养皿。让采集的血液静置凝固15分钟，然后离心。随后从血液中分离血浆，并将其在-80摄氏度下保存，以备后续分析。

接下来，称量每个含有 500 微升 PBS 的匀浆管。然后使用无菌活检打孔器从每份解剖组织中采集 4 毫米的活检样本。将活检样本分别放入匀浆管中，每管含一个 2 毫米珠子，每管放入一份皮肤样本。

将剩余组织置于4%多聚甲醛中，在4摄氏度保存用于显微镜检查，并称量匀浆管以确定活检组织重量。随后以6,000 RPM转速匀浆样品30秒，重复皮肤匀浆过程直至匀浆物呈糊状。最后，将每根试管中的细胞悬液涂布于新鲜琼脂平板上，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养过夜。

为了确定这些代表性结果中的器官菌落形成单位数，使用了一株表达绿色荧光蛋白（GFP）的脑膜炎奈瑟菌血清群C菌株。

血常规检测显示，静脉注射 1×10⁶ 菌落形成单位细菌后 5 分钟，血液中平均有 1.5×10⁵ 菌落形成单位/毫升的细菌循环。6 小时后，菌落形成单位平均降至 4.8×10⁴ 菌落形成单位/毫升；至 24 小时时，平均菌落数为 2.4×10⁴ 菌落形成单位/毫升。

但在这一组10只小鼠中，有5只未检测到循环细菌，而另外5只则具有相对较高的菌落数。这些柱状图上的条形表示从皮肤获取的每组菌落形成单位（CFU）计数的中位数值。样本显示，大多数小鼠在人皮肤中的细菌计数较高，在6小时时平均每毫克组织达到2.1 × 10⁴ CFU，在24小时时平均每毫克组织为4.4 × 10² CFU。

对侧小鼠皮肤样本在24小时时未检测到细菌计数，6小时时也仅有极低数量，表明细菌对移植组织中人源血管引起脑膜炎具有强烈倾向性。总体而言，其他取样器官中的细菌计数极低或无法检测，尽管有两只动物显示出一定细菌计数，这可能与血液循环中细菌数量较高相关。该模型还可用于确定毒力因子在体内的作用。

例如，在本实验中，使用了缺乏功能性 IV 型菌毛的小鼠感染模型，感染这些突变菌株的小鼠在人皮肤移植物中未观察到细菌黏附现象，从而证实了 IV 型菌毛在体内黏附过程中的关键作用。在感染后两小时拍摄的皮肤移植物共聚焦图像中，可观察到经凝集素 UEA-罗丹明标记的人血管。皮肤的表皮-真皮交界清晰可辨，且在整个血管系统中均可明显观察到表达 GFP 的脑膜炎奈瑟菌。

该经 H&E 染色的人类皮肤移植物显示出炎症和血管渗漏，以及集中在表皮-真皮交界处附近血管的血栓形成。感染后约 24 小时，在约 30% 的感染中，皮肤内的细菌黏附导致宏观上可检测到的紫癜形成。因此，该技术的发展为从事宿主-病原体相互作用研究的研究人员提供了途径，使其能够在人类血管背景下研究疾病机制。