通过骨髓移植区分免疫细胞与非免疫细胞中基因表达在小鼠结肠炎中的功能作用

本视频所展示实验的总体目标是评估抗菌肽lyin是否在缓解葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎中发挥作用。该目标通过将野生型小鼠的骨髓移植到经辐照的licit和敲除型小鼠体内，以及将敲除型小鼠的骨 marrow 移植到经辐照的野生型小鼠体内来实现。移植的骨髓将在受体动物体内生成具有供体基因型的新血细胞。

四周后，对受体小鼠施加葡聚糖硫酸钠以诱导结肠炎。通过流式细胞术验证移植是否成功，并通过组织学方法评估结肠组织损伤情况。实验结果表明，将野生型骨髓移植至基因敲除小鼠后，结肠炎症状得到改善。

相反，当将基因敲除的骨髓移植到野生型小鼠体内时，结肠炎会加重。该方法有助于解答在炎症或感染过程中，由骨髓来源细胞或非骨髓来源细胞所决定的基因表达相关关键问题。建议本实验使用 C57、black six 野生型小鼠以及 C elicited 基因敲除小鼠，以便能够追踪野生型小鼠与基因敲除小鼠。

骨髓移植后的供体细胞。使用 CD 45.1 小鼠代表野生型小鼠，CD 45.2 小鼠代表基因敲除小鼠。此处所示图表描述了实验设计：每组分配五只供体小鼠和十只受体小鼠。

对于A组和B组，将从野生型小鼠向敲除型小鼠移植骨髓。仅在A组中诱导结肠炎，而不在B组中诱导。对于C组和D组，将从敲除型小鼠向野生型小鼠移植骨髓，且仅在C组中诱导结肠炎。对于E组和F组，移植将从野生型小鼠移植至野生型小鼠；对于G组和H组，移植将从敲除型小鼠移植至敲除型小鼠。为准备供体骨髓并将其移植至经辐照小鼠，首先在生物安全柜中从已处死小鼠的骨骼中提取骨髓。

使用无菌解剖器械剥离附着的肌肉和韧带，暴露肱骨、股骨、胫骨和腓骨，并将其转移至培养皿中。剪开骨骼的两端以露出红色骨髓，然后用镊子夹住其中一根骨骼。

用3毫升注射器和25号针头，将预冷的PBS注入骨骼，冲洗出红色骨髓至另一个培养皿中。然后从骨骼的另一端再次冲洗，以获得更多的骨髓细胞。每根骨骼均重复此操作。

分别收集野生型和基因敲除小鼠的骨髓。使用带有18号半英寸针头的6毫升注射器，通过反复抽吸和推出来破碎红骨髓凝块。然后用血清移液管将收集的骨髓转移至50毫升锥形管中。

转移全部骨髓后，在4摄氏度下以740 G离心五分钟。离心结束后，弃去上清液，并通过涡旋振荡五到十秒钟重悬沉淀。向沉淀中加入每只供体小鼠5毫升的1倍红细胞裂解缓冲液，再次涡旋振荡五秒钟，并在室温下准确孵育三分钟。

三分钟后，向每根试管中加入 20 毫升冷 PBS，通过倒置混匀以终止裂解。然后将液体倒入装有 40 微米细胞滤筛的新 50 毫升锥形管中。用 5 毫升 PBS 清洗原试管，并将洗涤液转移至细胞滤筛中。

继续将流穿液收集到锥形管中。然后用 PBS 将体积补至 50 毫升，并通过倒置混匀。接下来，使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法测定活细胞数量。

确定细胞数量后，在4摄氏度条件下，以913 × g离心骨髓细胞5分钟。离心后，根据总细胞数弃去上清液。用PBS重悬细胞沉淀，调整浓度至每毫升含1 × 10⁸个细胞。

骨髓细胞现已准备好移植到经辐照的受体小鼠体内。本实验所用的受体野生型小鼠和基因敲除小鼠已按照随附文件所述接受1000 rad辐照处理。辐照后4至24小时内，将受体小鼠在加热垫上并置于保温灯下预热，以便注射供体骨髓细胞。将一只受体小鼠放入固定器中，用70%乙醇擦拭尾部，以消毒注射部位并促进局部血管扩张，便于注射。

使用带有28½号针头的胰岛素注射器，将1×10⁷个细胞溶于1至200微升液体中，注射入每只小鼠的尾静脉。注射后，将小鼠与最多三只其他已注射的小鼠共同置于同一笼中，持续四周。将注射后的受体小鼠饲养在高压灭菌笼中，并提供含有抗生素磺胺甲噁唑-甲氧苄啶（sulfa trim）的饮水。

这可以保证动物有足够时间恢复免疫力，每四天更换一次笼具、抗生素处理的水和食物以维持卫生。照射及骨髓移植四周后，改为饮用不含抗生素的常规水，并继续饲养小鼠两周，使其肠道正常菌群得以恢复。骨髓注射六周后，测量初始体重以诱导结肠炎。

给结肠炎实验组小鼠饮用含5%葡聚糖硫酸钠的水。五天后，用肝素包被的真空采血管收集四只小鼠的外周血，并置于冰上。然后在1.5毫升微量离心管中，将300微升血液与300微升细胞染色缓冲液混合，并将血液分装到五根已标记为1至5号的流式细胞术检测管中，每管100微升，置于冰上。

处死小鼠后，再次测量体重并计算变化值。解剖结肠组织并置于甲醛中用于 H 和 D 染色。然后按之前方法获取骨髓细胞。

将重悬的骨髓均分为五份，分别加入预先标记为一至五的微量离心管中，每管100毫升。为进行流式细胞术分析，参照随附文件在避光条件下为各管分别配制相应的抗体混合液：编号为一的血液与骨髓样本作为对照组，不进行染色；编号为二的样本将使用FITC同型对照、PE同型对照及CD16/32阻断液进行染色。

这些同型对照用于确认一抗结合样本的特异性。编号为3的样本将用FZ CD 45.1和CD 16/32染色。编号为4的阻断液样本将用CD 45.2和CD 16/32染色。

封闭液。单色标记可揭示血液或骨髓中供体或受体细胞的存在。显然，编号为5的样品将被染色以检测CD 45.1、CD 45.2和CD 16/32。

此处通过双色标记显示血液或骨髓中供体与受体细胞的相对比例。向各自的样本管中加入 5 µL 抗体混合物二和五。然后向各自的样本管中加入 3 µL 抗体混合物三和四。

将所有试管置于冰上孵育30分钟。孵育结束后，向每管中加入2毫升1倍红细胞裂解缓冲液。然后将样品置于冰上避光再孵育15分钟。

在 350 × g 条件下离心 5 分钟，温度为 4 摄氏度。离心后，弃去上清液，在避光条件下用 500 微升细胞染色缓冲液重悬沉淀。然后短暂涡旋振荡。

接下来，对免疫染色的血液和骨髓样本进行流式细胞术分析。选择FZ标记以代表野生型CD 45.1，PE标记以代表敲除型CD 45.2。使用Flo Joe软件分析流式细胞术结果。

通过计算fit E与PE的比值或PE与fit e的比值，判断供体基因型在血液和骨髓中是否为显性基因型。该图像显示了具有正常组织学特征和DSS结肠炎的结肠组织的苏木精-伊红（H&E）染色样本图像。组织学图像的评分依据是黏膜组织损伤程度以及中性粒细胞向黏膜层和黏膜下层组织的浸润情况。

因此，较高的组织学评分表明结肠炎更为严重，以此来检测lyin是否在预防结肠炎中发挥作用。骨髓在野生型小鼠和基因敲除小鼠之间进行交换，具体操作如本视频所述。随后对组织学结果进行评估并按此处所示进行评分。

当将基因敲除小鼠的骨髓移植到经照射的野生型小鼠中时，组织学评分显著升高；相反，当将野生型骨髓移植到基因敲除小鼠中时，评分则显著降低。这些数据表明，来源于骨髓细胞的内源性C具有抗炎作用，并能改善结肠炎，同时也验证了这些小鼠的移植操作已成功。

移植后，还对小鼠的骨髓和血液进行了流式细胞术分析。野生型骨髓对Fitz CD45.1染色强烈，但对PE、CD45.2无染色，如图所示；而基因敲除型骨髓对PE染色强烈，但对Fitz无染色，如图所示。然而，在移植后，接受基因敲除型骨髓的野生型小鼠，其骨髓和血液均对PE染色强烈，而对Fitz无染色，表明染色细胞的主要群体来源于供体。

同样，接受野生型骨髓移植的基因敲除小鼠的骨髓和血液对fitzy染色呈强阳性，但对pe不染色，再次证实主要染色的细胞群体来源于供体。观看本视频后，您应能够进行骨髓移植实验，并能够通过骨髓来源的细胞调控结肠炎。