利用荧光激活细胞分选法从鼠骨髓中纯化浆细胞样树突状细胞

本实验的总体目标是从易患狼疮的小鼠骨髓中高纯度地分离浆细胞样树突状细胞（PDC），以研究其功能。该方法有助于解答与特定免疫细胞群体特征相关的关键科学问题，例如在狼疮发展晚期产生干扰素α的PDC细胞。该技术的主要优势在于，与磁珠分选相比，可将一个或多个目标细胞群体富集至更高的纯度。

收获后，将后肢骨和4毫升完全培养基转移至研钵中。加入6毫升新鲜完全培养基，使总体积达到10毫升。然后用研杵轻轻敲碎骨骼。

轻轻搅拌研钵以释放骨髓。然后，将所有培养基通过70微米滤网转移至冰上放置的50毫升锥形管中。向研钵中加入10毫升新鲜完全培养基。

再过滤上清液两次，直至骨骼呈现白色。然后，离心骨髓细胞，并将沉淀重悬于10毫升新鲜完全培养基中。接着，将细胞小心地分层至15毫升锥形管中5毫升新配制的密度梯度介质上，注意不要破坏分层。

通过离心分离细胞。然后，小心移除上层8毫升溶液，收集位于界面处的2毫升白膜层。向分离得到的单个核细胞中加入12毫升冰浴的完全培养基，盖紧管盖后轻轻颠倒混匀。

然后，通过离心收集细胞。为了进行FACS染色，将细胞重悬于100 µL CD1632FC封闭抗体中，于4°C孵育。10分钟后，用4 mL预冷的分选缓冲液洗涤细胞，并加入100 µL适当细胞表面染色抗体混合物对细胞进行标记。

在4°C避光条件下孵育15分钟。用4毫升预冷的分选缓冲液洗涤细胞，以去除未结合的荧光标记抗体。然后，将细胞沉淀重悬于500 µL FACS上样液中，并将样品转移至冰上的FACS管中。

为染色补偿对照，每管分装 1 × 10⁶ 个脾细胞。用 4 mL 分选缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于 100 µL 分选缓冲液中。随后，向各对应的补偿管中加入主细胞表面抗体混合液中相应的荧光标记抗体，并轻轻振荡混匀。

在黑暗中、4摄氏度条件下孵育15分钟后，用分选缓冲液洗涤所有样品，并将沉淀重悬于500 µL预冷的分选缓冲液中。DAPI管除外，将其重悬于500 µL FACS上样溶液中。为通过荧光激活细胞分选法纯化目标细胞群体，在分选阀下方放置含有500 µL添加了抗生素的FBS的收集管。

接下来，加载未染色的对照管，收集10,000个事件以设定每种荧光强度的阴性门控；在单染补偿管中收集10,000个事件，以设定每种荧光强度的阳性门控；从实验样本中收集3,000个事件，以设定待分选细胞群体的门控。

以荧光强度作为X轴和Y轴图的参数，手动圈选目标细胞群体。随后，将目标细胞群体分选至收集管中。分选结束后，在细胞中加入最多四毫升的冰上预冷的完全培养基。

然后，盖上管盖，通过倒置混匀细胞。离心使纯化的细胞沉淀，弃去上清液，仅保留最后200微升。接着，将沉淀重悬于1毫升冰上预冷的完全培养基中，并将细胞转移至1.5毫升微量离心管中进行第二次离心。

最后，吸除上清液，仅保留最后100 µL，将分选后的细胞群体置于冰上保存备用。通过磁珠激活细胞分选法从小鼠骨髓中分选狼疮易感小鼠的浆细胞样树突状细胞，富集后纯度仅为7.75%。然而，经流式细胞分选（FACS）富集的浆细胞样树突状细胞，分选后纯度可高达96.4%。

为了确保高纯度，首先通过前向散射和侧向散射参数将单个核骨髓细胞与碎片分离并进行门控。利用前向散射宽度对前向散射高度以及侧向散射宽度对侧向散射高度，进一步对单细胞进行门控，以避免由细胞聚集体产生的假阳性信号。随后，根据活的单个DAPI阴性细胞的CD11c阳性、CD11B阴性表面表达特征进行门控，从而进一步筛选出B220阳性、PDCA-1阳性的目标骨髓浆细胞样树突状细胞群体。

分选后的PDC群体不仅纯度高，而且功能正常，能够在体外经CPG刺激后产生IFNalpha。在进行该操作时，需注意敲碎骨骼并轻柔搅拌以释放骨髓，从而保持细胞活力。完成此操作后，可进一步开展其他实验方法，如RNA测序或体外培养与刺激，以探究富集细胞群体的基因表达或功能相关问题。

该技术建立后，为PDC研究人员探索这种强效细胞在狼疮及狼疮易感小鼠模型发病过程中的作用铺平了道路。观看本视频后，您应能充分掌握如何从狼疮易感小鼠的骨髓中分离出高纯度的PDC群体。