使用活细胞荧光显微镜观察细菌毒素诱导的细胞反应

本实验的目的是观察免疫细胞对细菌毒素的反应。首先，在BL 21 gold细胞中表达并纯化毒素。在确认毒素活性和浓度后，将毒素递送至免疫细胞。

使用显微注射仪并结合高速活细胞显微成像技术进行观察。对所获得图像的分析揭示了免疫细胞对毒素反应的实时动力学过程。该方法有助于解答免疫学领域中的关键问题，例如炎症小体激活的机制。

尽管该方法可用于研究毒素介导的免疫细胞反应，但也适用于其他刺激物，包括趋化性引诱物。我们最初在研究细菌与培养的免疫细胞相互作用时提出了该方法，当时观察到细菌与免疫细胞之间的相互作用具有高度变异性。使用含有PAG三个SLO的BL 21 gold细胞培养物开始链球菌溶素O（strep lysin O）或SLO的纯化。

将他的质粒培养至 OD 值约为 0.6。为诱导蛋白表达，向培养物中加入 5 毫升 20% 的 OSes，于室温下以 225 转/分钟振荡培养 3 小时。接着，将细菌转移至 500 毫升离心管中。

然后在4°C条件下，以12,000 × g离心培养物12分钟，离心后弃去上清液。将沉淀置于-80°C下过夜或更长时间保存。为纯化表达的SLO，向冻存的沉淀中加入10毫升洗涤缓冲液，并补充Triton X-100、溶菌酶和苯甲基磺酰氟，用移液器上下吹打约15分钟。

进行重悬时，将沉淀物悬浮并保持样品置于冰上。将重悬后的沉淀物转移至一个50毫升橡树岭圆底聚丙烯管中。使用探头式超声仪在40%输出功率下对裂解液进行超声处理，每次30秒，共重复5次，每次间隔30秒，并在两次超声之间将样品置于冰上冷却30秒。

然后在 4°C 条件下，以 39,000 × g 离心超声裂解液 20 分钟。离心后，将细菌上清液加入 1 毫升经洗涤的镍 NTA 琼脂糖中。将镍 NTA 琼脂糖与裂解液在 4°C 轻柔振荡孵育 2.5 小时。

在4°C条件下，以400 × g离心5分钟，使磁珠沉淀。请注意，后续所有洗涤和洗脱步骤均采用此离心条件，除非另有说明。离心结束后。

取30微升上清液与10微升4倍SDS上样缓冲液加入微量离心管中，混匀后置于冰上，用于纯度分析。随后弃去剩余的上清液，并用裂解洗涤缓冲液洗涤磁珠4次，每次洗涤之间使用高盐缓冲液进行离心。从此时起，务必始终将样品置于冰上操作。

SLO 是一种对氧化还原状态极为敏感的蛋白质，即使短暂升温至 37 摄氏度，也会迅速丧失其活性。为洗脱 SLO 蛋白，向珠粒中加入一毫升洗脱缓冲液和五微升一摩尔的 DTT，冰上孵育 10 分钟。然后离心，并将上清液收集到标记有洗脱编号的离心管中。

重复此步骤三次后，为去除SLO蛋白中的内毒素，向样品中加入200 µL已洗涤的聚混合偶联琼脂糖珠（agro beads），该珠子悬浮于res盐缓冲液中，然后在4°C下振荡30分钟。随后在4°C下以10,000 × g离心1分钟。离心后，将上清液收集至新的已标记的微量离心管中。

将每次洗脱的30微升与10微升的4倍SDS上样缓冲液混合。进行SDS-PAGE分析时，将SLO溶液置于冰上保存。测定蛋白浓度和溶血活性，若结果满意，则将SLOE分装为5至10微升的等份，随后在干冰上速冻，并于-80摄氏度保存。

然后测定特异性裂解率。Reese。将待测细胞在缓冲液RB中以每毫升20微克的浓度重悬两次，每毫升含六百万个细胞。

碘化丙啶。此处检测 T 27 A 细胞。将 100 微升细胞分别加入 96 孔 V 型底板的每个孔中，每孔细胞置于单独的微量离心管内。

用缓冲液rb将SLO连续稀释至终浓度的两倍。然后向细胞中加入100微升毒素或100微升缓冲液RB，在37摄氏度孵育5分钟。典型的终浓度范围为每毫升2000单位至每毫升31.25单位。

使用流式细胞仪运行细胞，并用针对fi、cethrin或pe的滤光片收集数据。一个对数级移位代表瞬时通透性细胞，而三个对数级移位表明细胞死亡。通过从实验组中减去对照组的细胞死亡百分比，利用此处所示公式计算细胞的特异性裂解率。在实验前一天铺板，将五倍中心的巨噬细胞置于胶原包被的玻璃上。

底部为35毫米的培养皿。用于毒素递送的显微镜应配备倒置载物台、加热载物台、合适的激发-发射滤光镜组，以及如有条件，应配备伯特兰透镜。该操作过程中最困难的部分是将针头完整地降至细胞位置。

为了确保成功，我们使用贝特兰透镜（Bertrand lens），该透镜通常用于对准，以便在将针穿过焦平面时观察针的位置。显微镜应连接显微注射仪，并由一台具有足够内存的计算机控制，以采集和存储数据、开启显微镜和显微注射仪，并在等待载物台加热的同时，使加热载物台有足够时间升温至37°C。在37°C条件下，用染料对细胞标记30分钟。

根据实验要求，标记时可使用五微升、四微升或凌晨两点在一千微升 HBSS 中，或在一千微升完全培养基中加入两微升钙指示剂，此处使用四微升或两微升。移除细胞培养基，并用 PBS 洗涤细胞一次。吸除 PBS，加入一千微升 RPMI 培养基，其中添加二毫摩尔氯化钙。

将培养皿安装到显微镜上，使用明场使细胞对焦，然后调整焦距至略高于细胞的位置。接着，取一微升 SLO 毒素、四微升浓度为 10 毫克/毫升的 DEXTRA 5 55 以及六微升水进行混合。然后，在 4 摄氏度条件下，以 20,000 × g 离心 10 分钟。

使用葡聚糖可验证飞升移液尖端是否未被堵塞。使用微量移液器从后端向飞升移液尖端中加入两微升稀释的毒素。将飞升移液尖端安装到显微注射仪上。

然后调整注射器的角度，使针尖位于细胞中心上方，并留有在各个方向移动的空间。清除Z轴限位的先前设置，该限位用于控制显微注射针尖下降的最低位置。将显微注射仪设置为在120 PSI压力下注射0.5秒，反向压力为20 PSI。然后降低针尖，直至其进入培养基中。

使用 Bertrand 透镜。将针尖居中，并在针尖逐渐靠近细胞时持续追踪。一旦针尖偏离焦点，立即切换回常规光学模式。

视野中应能清晰看到针头的阴影。先将焦点置于细胞上方，然后降低针头直至其进入焦点范围。接着调整细胞至清晰对焦，并小心地将针头移至靠近某个细胞的位置。

设定注射的Z轴限制后，开始成像并注射毒素。然后抬起针头，移动至新的细胞区域。再次注射毒素，并在注射后继续成像。

使用本视频中所述的方法将针头移至初始位置，以防止针头发生任何意外的毒素泄漏，毒素浓度为每毫升10的7次方至10的8次方单位。SLO通常在蛋白浓度为每毫升4毫克时获得。此SDS-PAGE凝胶显示了毒素诱导前后以及纯化后的细菌样品，三次考马斯亮蓝染色结果均表明，诱导表达的SLO已成功纯化。

SLO 是指分子量为 69 千道尔顿的条带，用于确定裂解 T 27 A 或 D 两种细胞所需的毒素量。在 37 摄氏度下，用不同浓度的 SLO 处理细胞 5 分钟，同时加入碘化丙啶，随后通过流式细胞术进行检测。特异性裂解率的测定方法如图所示。

每毫升250单位。SLO对T 27 A和D两种细胞均能产生50%的裂解。毒素的亚裂解剂量（10%裂解）为每毫升62.5单位。

这些数值对于评估毒素暴露后细胞死亡的基准毒素活性具有重要意义。人皮肤成纤维细胞使用 Life Technologies 公司的活死细胞检测试剂盒，与钙离子和 atherium 同源二聚体共同孵育。在局部暴露于细菌毒素 anthro lysin O 后，在此图像中，钙离子显示为绿色，靠近微生物组的区域中 atherium 溴化物显示为红色，表现出以钙流失和 athe 同源二聚体摄取为特征的细胞死亡；而远离尖端的区域则无损伤表现。

毒素的微量递送还允许检测钙流等实时事件。这些负载了4:02 AM的人源树突状细胞在恒定流速下暴露于SLO，同时进行活细胞成像，观察到荧光信号由绿色向蓝色转变。伪彩显示细胞质钙水平升高。

SLO 会引发胞质钙离子的快速增加，由于局部递送，这种增加会在培养皿区域内传播。然而，只有靠近微注射器尖端的细胞才会接触并响应毒素。这既展示了单个细胞对毒素的反应，也体现了毒素递送在空间上的局限性，从而可在 zdi 维度上解析事件。

微递送技术与高速三维共聚焦显微镜相结合。这组图像显示了毒素注射后树突状细胞的反应。这些细胞预先与绿色荧光标记的抗CD11c抗体（与PC偶联）孵育，以标记细胞膜。

如图所示，微囊泡在毒素递送后被释放。作为细胞修复过程的一部分，毒素分子会富集于膜出泡处，并通过脱落这些出泡来清除毒素。一旦掌握，显微镜观察可在45分钟内完成。

在进行该实验操作时，务必记住在与细胞混合前保持毒素处于低温环境，并检测其溶血活性。很好。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用活细胞显微镜技术实时测量免疫细胞对细菌毒素的反应动力学。