利用细菌病原体探究宿主在细胞和有机体水平的应答

在细胞内复制的微生物病原体最终必须离开被感染的细胞。与宿主-病原体相互作用的其他方面相比，这一过程的研究相对不足。本文中，我们描述了用于分析病原体外排的实验技术。

我们将展示如何利用相对简单的实验方法来评估外排效率或表征外排后的病原体。此处描述的通用技术具有广泛的适用性，尽管针对特定病原体与宿主细胞的模型可能在动力学、剂量以及可能的检测读数方面有所不同。如同建立任何实验系统一样，必须设立明确的对照，以确保在实验样本或队列中观察到的是真实的生物学过程。本次实验操作将由我实验室的研究生 Petoria Gayle 进行演示。

开始感染实验时，使用移液器将 20 µL 新鲜配制的 Lm 接种液加入培养板孔中，将培养板略微倾斜，小心将移液器吸头置于覆盖的培养基液面下，避免吸头接触孔壁。轻轻吹吸混匀各孔中的液体，以确保充分混合。

不要振荡或大幅倾斜培养板，以免将LM扩散到孔壁上。将细胞培养皿放回37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。使用未感染细胞的条件培养基作为稀释液，配制10微克/毫升的庆大霉素溶液。

感染后30分钟，小心地向培养皿中加入30微升庆大霉素溶液，使终浓度达到每毫升2.5微克。轻轻吹打孔内液体以混匀，并将细胞培养皿放回培养箱。收获时，将培养皿略微倾斜，小心使用移液器吸除孔内全部培养基。

向孔中加入0.5毫升蒸馏灭菌水。30秒后，将所得水裂解液转移至1.5毫升微量离心管中，剧烈涡旋振荡10秒。取4.5微升和50微升水裂解液，分别加入450微升蒸馏灭菌水中，制备十倍和一百倍稀释液。

轻轻涡旋以确保充分混匀。取50微升原始十倍稀释和一百倍稀释的样品，加入LB（Lysogeny Broth）琼脂平板中，使用涂布棒均匀涂布。为检测新出现的LM，从培养皿中吸取10微升上层液体，分装为两份，每份5微升，分别加入微量离心管中。

向一份等分试样中加入5 µL DMEM/FCS，向另一份等分试样中加入含有5 µg/mL庆大霉素的DMEM/FCS 5 µL作为对照。室温下静置5分钟。向每份等分试样中加入90 µL无菌蒸馏水，剧烈涡旋振荡10秒。

然后取50 µL样品加入LB琼脂平板中，使用涂布棒涂布均匀。将平板置于37 °C培养箱中培养两天，然后计数单核细胞增生李斯特菌（Lm）菌落。使用自动细胞计数仪，将制备的原始264.7细胞调整至浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升。

向六孔组织培养板的孔中加入一毫升样品。用制备好的单核细胞增生李斯特菌（Lm）接种物感染细胞，感染复数为50。感染后1.5小时，在装有500微升4%多聚甲醛（PFA）的一点五毫升微量离心管中收集第一组孔中的培养基，并将该管置于冰上。

为收集胞内单核细胞增生李斯特菌（Lm），向每个孔中加入一毫升无菌蒸馏水。60秒后，将所得的水裂解液转移至含有500微升4%多聚甲醛（PFA）的一点五毫升微量离心管中。剧烈涡旋振荡该管10秒，然后置于冰上。

对于其余孔，吸除培养基，并加入一毫升含每毫升五微克庆大霉素的DMEM/FCS，以杀灭胞外李斯特菌（Lm）。立即将培养皿放回培养箱中。30分钟后，吸除培养基，并更换为不含庆大霉素的DMEM/FCS。再经过两小时和四小时后，分别第二次和第三次收集裂解液中的培养基至离心管中，并置于冰上冷却。

将离心管在10,000 × g条件下离心七分钟。使用移液器小心移除上清液，避免扰动沉淀。向管中加入染色液混合物，包含50微升4%多聚甲醛和15微升鬼笔环肽，混匀以重悬各沉淀。

将离心管置于4°C避光孵育20分钟。孵育结束后，向每根离心管中加入1毫升FACS缓冲液，用移液器上下吹打混匀。将离心管放入离心机中，在10,000 × g下离心7分钟。

去除上清液时勿扰动沉淀。如需立即使用，将每份沉淀重悬于400 µL FAX缓冲液中。如需保存以备后续分析，则向管中加入200 µL FAX缓冲液和200 µL 4% PFA，混匀以重悬沉淀。

采用简短的抗生素庆大霉素处理条件以消除未内化的单核增生李斯特菌（Lm），在与培养的巨噬细胞共孵育1.5小时后，可回收到0.15%的野生型Lm。在随后的共孵育过程中，可回收的活Lm数量分别增加了4倍和7.5倍，这些增加完全代表了胞内增殖。在初始感染期间，携带高毒力prfA的Lm菌株表现出类似的趋势，但在感染后3至6小时之间则未观察到相似的增殖模式。

当从单核细胞增生李斯特菌（Lm）菌株中删除 prfA 基因后，在长期共孵育后该菌株的回收率随之降低。在感染后6小时（HPI）去除庆大霉素后，一小时后可在细胞外检测到野生型和高毒力 prfA 菌株，但无法检测到 prfA 缺失的菌株。覆盖在未感染和感染的巨噬细胞上的培养基均含有散射光的、大小与细菌相当的颗粒物质。

然而，仅感染的巨噬细胞培养基在设定的尺寸门控范围内显示出GFP阳性信号。在感染的巨噬细胞中，可见鬼笔环肽阳性单核细胞增生李斯特菌（Lm）的数量随时间推移而增加。将巨噬细胞接种至48孔组织培养板时，需留出部分孔不加细胞。

这些无细胞对照孔需与含细胞的孔一样，接受相同的处理，包括添加病原体、抗生素等，以确保实验信号依赖于宿主细胞的存在。与图一和图三所示实验类似，可检测病原体或宿主因子和/或小分子对病原体细胞外排的影响。