利用荧光素酶生物发光报告系统监测细胞自主性基因表达的昼夜节律

本方案详细介绍了荧光素酶报告基因细胞系的构建，以及随后对生物发光表达的细胞自主昼夜节律的监测。首先构建慢病毒荧光素酶表达报告载体，并制备慢病毒颗粒，随后感染目标细胞并扩增筛选后的细胞培养物。然后，使用适当的记录设备监测同步化报告细胞中生物发光的表达。

最终，通过生物发光记录来证明细胞自主的昼夜节律。该技术相较于现有的瞬时转染和生殖系保护方法的主要优势在于，VIR 是介导的。该基因可实现向细胞基因组的稳定整合，同时具有更高的效率和多功能性。

该方法有助于回答生物钟研究领域中的关键问题。例如，是否存在组织特异性的昼夜节律钟？如果存在，这些组织特异性生物钟具有哪些特性？

尽管该方法可为生物钟机制提供深入见解，也可应用于其他系统，例如细胞周期动力学、肿瘤发生等。我们最初是在决定研究组织或细胞类型特异性生物钟时提出了该方法的想法。

演示该实验操作的是来自我实验室阿托里实验室的博士后研究员Chita Norm Napkin博士和研究生Sandra。典型的哺乳动物昼夜节律报告基因载体包含一个表达盒，其中昼夜节律启动子与荧光素酶基因相融合。在此慢病毒报告载体中，不稳定的荧光素酶基因受小鼠per2启动子的调控。

有关通过重组反应构建报告载体的详细说明，请参阅随附的手稿以进行高效转染。使用低代次、融合度为90%至100%的人胚胎肾细胞培养物开始实验。接下来，对六孔培养板进行包被处理。

进行转染时，向每个孔中加入1毫升0.001%的多聚赖氨酸，室温孵育20分钟，然后用PBS冲洗一次。接着，用胰蛋白酶消化收集细胞，并将细胞接种至预先包被的培养板的每个孔中。轻轻晃动培养板以获得均匀的细胞分布。

在1.5毫升微量离心管中确认接种的细胞已达到80%至90%的融合度。准备慢病毒报告质粒DNA与三种包装载体的质粒转染混合物，作为转染及后续感染的对照。另设一孔，加入携带在CMV启动子调控下的增强型绿色荧光蛋白的慢病毒GFP表达载体。

接着，向质粒中加入 100 µL 0.25 摩尔的氯化钙，并充分混匀。然后加入 100 µL 2×BBS 溶液，轻柔但彻底地混匀。将 DNA 混合物在室温下孵育 15 分钟。

等待期间，将293T细胞中的培养基更换为2毫升新鲜培养基。将培养板放回培养箱中，至少孵育10分钟以平衡培养基的pH值。随后以逐滴加入的方式将转染混合物加入细胞中，轻轻摇晃培养板，并在显微镜下观察颗粒形成情况，然后将细胞置于培养箱中过夜培养。

转染后约16小时，更换为2毫升新鲜DMEM培养基，继续培养过夜。随后，为评估转染效率，检测转染对照细胞中的EGFP表达。若EGFP表达水平高，转染效率达到90%至100%，则可作为获得良好病毒制备的可靠指标。

收集含有分泌型感染性病毒颗粒的培养基，离心去除残留的293T细胞，并收集含病毒的上清液。第3天，在12孔板中接种约12,000个293T细胞，过夜培养至细胞汇合度达到20%至30%，于第4天观察细胞状态。仍在第4天，向收集的含有病毒颗粒的培养基中加入多聚素（polybrene），并通过移液充分混匀。

现在吸去三个 T3 细胞中的培养基，每孔加入一毫升病毒混合液。用 PBS 洗涤细胞一次后，在 37 摄氏度下孵育过夜，补充培养基，并在 37 摄氏度下继续孵育细胞过夜以恢复和生长。当细胞达到汇合时，传代细胞并在次日继续培养过夜。

为开始筛选感染的细胞，加入含有每毫升10微克的培养基。巴斯特酸（blastic aside）在杀灭载体中的用量需针对每种细胞系进行经验性确定。每两到三天更换一次含有巴斯特酸（blastin）的培养基，以持续筛选具有抗生素抗性的细胞。

表达生物钟报告基因。将具有博来霉素抗性的报告基因细胞在35毫米培养皿中扩增至汇合后，通常每种条件下每种报告基因细胞系需准备三个或更多培养皿，以用于sarcy表型分析。用PBS洗涤一次后，加入含有10微摩尔荧光素或200纳摩尔地塞米松的DMEM培养基，在37摄氏度孵育1小时以同步化细胞。

现在将细胞放入新配制的记录培养基中。用40毫米的无菌盖玻片覆盖培养皿，并用真空脂密封以防止蒸发。将培养皿装载到Lumous循环光度计上，开始实时生物发光检测。

记录 96 孔老培养板的记录。使用 GSR 两个记录装置，参见随附的手稿。我们可在黄体周期分析程序中轻松记录五到七天的节律。

首先对原始数据进行基线拟合。然后利用减去基线后的数据拟合正弦波，以确定持续节律样本所需参数。由于瞬时发光信号较强，拟合优度通常可轻松达到90%以上。

启动感应并更换培养基。在数据分析中，我们通常排除第一个循环的数据。必要时，将原始数据对时间作图。

绘制基线校正后的数据，以比较在293T细胞的瞬时转染和细胞系感染中的振幅和相位。转染和转导后表达GFP的细胞的荧光图像表明，慢病毒介导的基因递送系统具有很高的效率。昼夜节律钟的核心反馈环路由转录因子组成，这些因子作用于昼夜节律增强子元件，从而产生节律性基因表达。

在此实验中，三种T三细胞中的四种不同报告基因构建体产生了不同相位的报告基因表达。通过RNA干扰介导的基因敲低和药理活性化合物，利用多个昼夜节律元件的组合调控，可生成新的中间相位。本实验采用Lumicycle化学发光仪，对35毫米培养皿中的U2 OS细胞进行生物发光记录。

使用Irna来阐明cry one和cry two基因的敲低效应。此处采用Synergy发光仪对96孔板中的T3报告细胞进行生物发光记录。

采用RNA评估三联基因敲低对细胞节律的影响。本示例中，使用UX系统和Tecan发光仪对3个84孔板中的细胞进行生物发光记录。尽管如图所示选择了特定孔板，小分子仍可通过药理学手段靶向并干扰U2 OS报告细胞中与细胞节律相关的蛋白质功能。

在该技术开发之后，为昼夜节律生物学领域的研究铺平了道路，使得研究人员能够在不同类型的细胞和组织中探索生物钟机制及其生理功能。观看本视频后，您应能充分理解如何生成荧光素酶报告细胞系并监测其发光信号。

此外，请务必注意，操作病毒（VIR）可能具有极高的危险性，因此在进行该操作时，必须始终采取相应的预防措施，例如个人防护和病毒去污处理。