使用微阵列进行细菌基因表达分析

大家好，我叫Ena，我们在实验室常规进行基因表达谱分析。我们使用这种技术来监测甲基化型与野生型之间差异表达的基因。今天，我准备了野生型和甲基化型的RNA样本，接下来我们将首先进行cDNA合成。

我们采用间接标记方法，该技术的优势在于可避免直接标记中可能出现的视觉偏差。为此，我们准备了RNA样本，并选择将3微克RNA溶于13微升总体积中。随后，向我们的反应体系中加入2.5微升随机引物（random hexamers）。

将样品在75°C下孵育8分钟，以使RNA变性。随后加入逆转录反应体系，其中包含dNTP混合物、逆转录缓冲液以及逆转录酶，混匀后于42°C孵育4小时。4小时后取出样品即可。

现在试管中含有 cDNA 和 RNA 的混合物。接下来需要通过加入氢氧化钠和 EDTA 来水解 RNA，其中氢氧化钠的终浓度应为 100 摩尔，EDTA 的终浓度应为 5 摩尔。

现在将样品在65摄氏度的水浴中孵育10分钟。孵育完成后，通过加入pH 7的HEPES缓冲液，使样品终浓度达到500摩尔。此时，可将样品储存于-20摄氏度，或继续进行纯化步骤。

为了纯化cDNA，我们使用KaiGen PCR纯化试剂盒。然而，由于Bush缓冲液和离子缓冲液含有游离成分，因此我们不使用试剂盒中的这两种缓冲液，而是自行配制fate Bush缓冲液和fate离子缓冲液。接下来，加入300 µL的PPI，并缓慢吸取该溶液，然后将混合物转移至纯化柱中。在最高转速下离心一分钟，弃去流出液。随后，加入750 µL磷酸盐洗涤缓冲液，再次离心；之后再加入相同体积的洗涤缓冲液重复洗涤一次。

因此，我们将再次离心，以确保完全收集到所有沉淀物。然后将这些管中的样品转移至空的离心管中。接着，我将加入30 µL磷酸盐E缓冲液，该缓冲液为pH 8.5的0.4 mol/L磷酸钾溶液。

此时，您只需确保将所有物质加入到柱子的中心位置，并在室温下孵育一分钟。随后再次离心一分钟，然后加入 30 µL 洗脱缓冲液，在室温下孵育。之后取出柱子，最终得到的总体积为 60 µL 的 CDA 溶液。

一旦我们纯化了cDNA，就可以将其在-20°C下保存；我们也可以将其干燥后再储存，例如可通过真空离心将cDNA干燥。现在离心管中的cDNA已呈干燥状态，且经过了修饰。接下来的操作是，我将用溶液重新悬浮该干燥样品。

我将用10 μL pH为9的15 mmol/L碳酸氢盐缓冲液重悬样品。在此步骤中，只需上下吹打即可，这一步非常重要，必须充分重悬cDNA。为了确保标记反应顺利进行，该反应应在避光条件下进行，因为荧光标记物对光敏感。

然而，这些来自生命科学领域的选项是单独包装的。S5 带有紫色盖子，而侧边的 3 号带有橙色盖子；此外，S5 在悬浮时呈现青色，Cary 呈现品红色。因此，我将在暗室中将这些样品转移至染料管中，重新悬浮染料，然后再将其转移回我原有的试管中。

然后在避光条件下孵育两小时，孵育结束后，通过加入35 µL浓度为100 mM、pH 5.2的醋酸钠溶液终止反应。随后，我们采用类似的纯化步骤进行纯化，但此次使用Cajun提供的洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。

您可以描述一下将样品放置的位置，这样可以清洁仪器。因此，您可以立即放入您的样品或混合物。这是我的标记为 scifi 的样品，此处我们看到的是 OD 260，它显示了 CDA 含量，以及 OD 650，它显示了 scifi 的 D 掺入情况。这是我的标记为 side three 的样品。

再次，扭转六个浓度和五个50测量位点的三处整合。由于我的D公司高效运作，我将合并样品。现在，Ms.Miss 简要地操作一下。接下来，我们将利用反馈再次编写一个样本。

好的，为了进行载玻片的活化，我们将通过将载玻片置于水面上方进行再水化，从而使点样区域扩大。随后，为了保护样本，我们将其在100°C下快速干燥，接着通过紫外照射使点样样本与载玻片交联固定，然后将载玻片放入预先准备好的预杂交缓冲液中孵育。因此，我将载玻片正面朝下放置，但此时尚未接触水面。

我们将这样等待五分钟。我，这个盒子看起来更大，它们应该比放入前更有光泽，只需将载玻片放在100摄氏度下使其迅速干燥，并观察是否有冷凝现象。接下来，我们将与youi进行交联。

因此，在水化过程中，我只需将载玻片浸入预热的水中即可。此步骤应非常迅速，因为这一步的目的是去除点样位置上所有未连接的斑点或寡核苷酸。如果此过程进行得过慢，你的点样位置就会出现拖尾现象。

因此，请确保操作迅速，并且在30秒内完成操作时不要将样本从水中取出。室温下立即孵育5分钟，700 rpm。得到样本后，将其放入我们已准备好的预热管道站缓冲液中，缓慢地将载玻片推入染色缸，并在42摄氏度下孵育至少45分钟。此处我们已有待杂交的干燥样本，首先将其重悬于水中。

在此步骤中，我们只需通过上下颠倒的方式重新悬浮沉淀，注意不要让样品暴露过久而变白。然后加入1.5 μL的鲑鱼精子DNA，其浓度为10毫克/毫升，再加入1.2 μL的TRNA。

浓度为每毫升12.5毫克，我们加入tRNA和鲑精DNA以阻断非特异性杂交。然后加入5.35微升0.3×SSC，使其终浓度为3×。最后加入3.5微升1% SDS。

现在我们将混合物煮沸五分钟，然后以最高速度离心五分钟，即可进行后续操作。自从我们孵育载玻片以来已过去一小时，目前我已准备好水和异丙醇。因此，我将首先在水中振荡载玻片以去除SDS，然后用异丙醇洗涤，再直接放入标准量规中。

在此过程中，需注意避免切片暴露在空气中过久，以防干燥。因此，我直接将载玻片从平衡站缓冲液转移至水中，并进行清洗。清洗数分钟，注意移动方向仅限上下，不可左右晃动。

同时确保切片不暴露在水面以上，并立即将其转移至异丙醇中。再次在此停留几分钟。请将您的切片在室温下放置五分钟？

700 R.Cool。因此，我们的载玻片也已准备好进行杂交，最好将其保存在载玻片盒中，以防止受到外界污染。对于收获站，我们将使用 lift 或 slip。

盖玻片上有白色的条带，它们可以提供一定的抬升空间，为样品在盖玻片和载玻片之间留出位置。我用乙醇将其清洁，然后放置导线，确保没有测试颗粒存在。首先，取我们已标记打印区域的模板载玻片，在其上方放置我们准备好的载玻片，并确保两者完全对齐。

确保它们完全对齐。并且需要确保条带位于侧面，我们将使其朝下。因此很难看清，但请务必确认您能够看到。

条带应位于载玻片的两侧。我们将从侧面加入样品。我取少量样品，先取 15 µL，从盖玻片的角落开始加样。

然后缓慢地将其拉入，并沿着边缘移动，以覆盖整个区域。此阶段非常重要的一点是避免引入任何气泡，我再取15 µL封片剂，将其加到玻片侧面，以防止干燥。我们的样品现已准备就绪，接下来将玻片放入杂交盒中孵育，该杂交盒具有微通道，可在杂交过程中保持玻片的湿润状态。

我们将把 10 µL 的 3× SSC 加入载玻片的六个角落。在每个腔室的每个角落以及每侧各加一处，共六处。转移载玻片时务必轻柔操作，以确保盖玻片不会滑脱。当您将载玻片正面朝上放置时，会看到它会与之前加入的水结合并固定住盖玻片。请确保螺丝已拧紧。

我们将杂交室置于65度的水浴中孵育，但不要将其直接放在底部。因此，我们放置某种塑料隔板以防止过多的热量传递。然后轻柔地放入我们的杂交室，为防止任何移位，还可以放置某种重物。

该孵育通常需过夜进行，时间一般为10至12小时。对于切片的洗涤，我们使用含0.05% SDS的1倍XSSC溶液，以去除盖玻片。

这一步将用于第一次洗涤。接下来仅使用 0.06% 六倍 XSC 溶液进行另外两步洗涤，洗涤所有已有的 SDS。然后我们将盖玻片拧紧，取出载玻片并将其正面朝下放入孵育盒中。

我们只需左右轻轻摇晃，就会看到盖玻片缓缓脱落。好的，接着将其转移到含有 XES 的另一洗涤缓冲液中。孵育一分钟。

转移至06号XSSC。为确保完全去除所有FDS，需再重复一次该步骤。在室温下以700 ×g离心5分钟以干燥。由于该载玻片对光敏感，请将其保存在载玻片盒中。

这是切片扫描仪，您需要将切片放在这里，就是这个小空间内，将切片正面朝下放置，标签朝向内侧。在第二张切片中，您只需定义想要扫描的区域。我们将在切片上选取该区域。我们的切片使用16针打印。

因此，每个方块对应一个针头，我们的载玻片包含超过 8,000 个点。由于病毒基因组大约有 4,000 个基因，我们对病毒基因组进行了两次重复表示，因此我们使用的每个寡核苷酸都有两个点。

如果放大观察，在本实验中，我们将转录调控因子突变体与野生型进行比较，其中突变体用 scifi 标记，呈现红色；野生型为 site three，呈现绿色。因此，任何呈现红色的区域（如这些斑点）表明该转录本在突变体中的丰度高于野生型。

因此，它们呈现红色或不同深浅的红色，而任何呈现绿色的区域表明该转录本在野生型中的丰度高于突变体。任何呈现黄色的斑点则表明该转录本在突变体和野生型中均等存在。因此，当两者信号叠加时，会呈现黄色，如这些斑点所示。