活细胞中DNA损伤应答蛋白的二维与三维实时成像

本演示利用二维和三维活细胞成像技术，以研究DNA损伤应答过程中相关蛋白质的空间-时间关系。首先，将您所选的细胞系转染或转导含有适当荧光标记的表达载体。此处使用M Cherry和GFP，随后获取一系列对照视频，显示在正常条件下荧光标记细胞的图像。

然后施加适当的处理，捕获处理对荧光细胞过程的影响数据，并分析视频数据中蛋白质的空间-时间关系。最终，活细胞荧光显微镜可以详细揭示细胞动态过程，例如在DNA损伤剂作用下53BP1焦点的形成，或53BP1在有丝分裂期间的行为。我们最初对二维和三维活体成像产生兴趣，是源于希望研究不同处理对特定细胞系有丝分裂的影响。

这种实验方法使我们能够比传统方法更简便地研究DNA损伤反应和基因组稳定性的维持。此外，您还可以利用该方法研究特定蛋白质在不同信号通路及多种细胞系中的相互作用。与细胞化学等传统技术相比，活细胞成像的主要优势在于能够实时观察DNA损伤反应相关蛋白质的动态变化。

优化合适的记录条件可能具有挑战性。本演示可用于观察为确保成功所需的诸多细微步骤。请记住，在减少光漂白、确定合适的记录时间间隔和记录时长等方面，坚持不懈终将取得成效。

将表达 mCherry 和 GFP 融合蛋白的质粒转染或转导至相应的细胞系中。在药物筛选条件下培养细胞，并在成像前一日定期检测荧光蛋白的表达情况。使用胰蛋白酶消化收集细胞。

然后将低密度培养物接种到3.5厘米荧光培养皿玻璃底板上。本实验方案采用配备Axio Observer Z1支架的Zeiss Cell Observer SD转盘共聚焦显微镜进行。首先，确认CO2气体已通入培养系统中的CO2模块。若显微镜配有防震气浮台，则需打开气浮台的气源供应。

现在打开显微镜支架、转盘式共聚焦单元相机、孵育模块、HXP 光源、电动载物台、氩离子激光器以及计算机的电源。打开将要使用的激光线路的开关。启动 Axio Vision 软件。

Avision 软件可根据其控制的显微镜及组件配置特定的窗口和下拉菜单。因此，每个用户界面的外观可能各不相同。成像前约一小时，找到培养箱的控制装置，并开启上腔室和载物台的加热功能。

将温度设置为 37°C。打开 CO2 控制，并将浓度设为 5%。选择用于成像的物镜。本研究中使用的物镜需要使用折射率与水相近的浸没介质。

如果需要在较长时间内对多个位置进行成像，请确保添加足够的浸没介质，以防止镜检过程中介质干燥。将培养皿放置在载物台上，并通过显微镜控制装置或软件将物镜升至与培养皿底部接触。将发射光引导至目镜，并为感兴趣的荧光信号选择合适的宽场滤光片组。

现在通过目镜观察。使用软件或显微镜控制装置调焦图像，并找到一个合适的细胞视野。在软件中将发射光引导至装有共聚焦转盘装置的端口，远离目镜。

开启本研究所需的合适激光器。对于每个通道，通过调节可调谐滤光片控制装置将激光强度调整至适当水平。然后，选择合适的二向色镜和发射滤光片。

打开转盘单元的快门。然后选择实时成像窗口以显示当前视野。接着打开相机控制窗口。

选择要使用的相机，并将曝光时间设置为约100毫秒。根据需要调整百分比和EM增益。同时，打开共聚焦转盘装置的控制界面，通过输入已设定的相机曝光时间来调节转盘转速，以获取合适的图像。

单击“设置”以锁定更改。现在打开多维采集窗口。选择通道选项卡，并加载或选择为 Flora Fours 定义的适当通道。

为确保图像配准，两个通道应使用同一块二向色镜。将软件设置为自动聚焦。进入 MDA 窗口后，点击 ZS 叠层标签。

在当前焦点位置选择ZS堆栈。设置10微米Z轴范围，并选择合适的步数，以确保在Z轴方向实现奈奎斯特采样。然后点击开始，分析生成的Z堆栈图像。选择时间标签页。

设置成像时间点之间的间隔以及整个实验的持续时间。若需对培养皿中的多个细胞进行多点成像，请打开 MDA 窗口。选择“位置”选项卡，并确认已勾选“在每个时间点之前或之后应用设置”。

现在选择标记。通过实时预览找到目标区域，移动培养皿并选择合适的视野。在多维采集菜单中点击“开始”，以启动实验并录制对照视频。

继续加入适当的处理，并在预定的时间间隔内以确定的持续时间记录实验视频。针对该细胞系以及为监测整个有丝分裂过程，我们采用每7.5分钟拍摄一次，持续4至5小时。您需要根据您的细胞系及研究目的确定特定的设置参数。

打开 Velocity 软件，创建并命名一个新的库，导入实验视频文件以查看文件。尝试使用扩展聚焦设置，根据需要调整视频。Velocity 配备了一系列工具，可帮助提高所获取图像的质量。

如果显微镜的设置恰当，后续编辑时将节省大量时间。通常对图像进行去卷积处理，并根据实验的具体需求调整亮度和对比度会很有帮助。要以三维方式观察细胞，请切换至三维不透明度设置。

这允许在空间中旋转三维渲染的细胞，从而提供细胞内感兴趣结构的多个视角。电影文件。可根据用户偏好将静态图像导出为多种文件类型。与对照组相比，暴露于CPT的成纤维细胞在5至10分钟内形成焦点，并在整个记录期间维持这些焦点。

有趣的是，在人胚胎肾细胞中，53BP1在有丝分裂开始时从染色质上解离，形成围绕凝缩染色体的薄雾状结构。随着末期的到来，有丝分裂接近结束，53BP1再次聚集形成明显的焦点结构。我们希望本视频能够帮助您研究参与DNA损伤应答以及其他通路的蛋白质在时空上的动态关系。

例如，在染色质动态研究领域，该技术被用于研究53BP1结合对DNA端粒末端运动的影响。在构建基因修饰细胞后，可在大约4至8小时内进行二维和三维活细胞成像。请确保调整显微镜设置，以获得最佳成像效果。