三维水凝胶中的FRET成像
2016年8月1日
荧光共振能量转移（FRET）成像是一种用于实时细胞生物学研究的有力工具。本文介绍了一种利用常规落射荧光显微镜在生理性的三维（3D）水凝胶微环境中进行FRET成像细胞的方法。同时描述了一种针对比率型FRET探针的分析方法，该方法在激活范围内可产生线性比率结果。
本实验方法的总体目标是通过FRET成像技术，对嵌入模拟天然组织的三维水凝胶中的细胞进行细胞内信号通路的实时研究。该方法有助于解答发育生物学、药理学和再生医学领域中的关键问题，例如优化生物材料的开发以及在工程化三维微组织中进行高通量药物筛选。该技术的主要优势在于，可利用常规的宽场显微镜系统，在多种类型的水凝胶中对大量细胞进行FRET分析。
根据文本方案，在组织培养罩内，使用无菌技术将含有细胞的前体溶液加入到用于水凝胶浇铸的模具中。在交联之前，对悬浮于水凝胶前体中的细胞进行离心，使细胞集中于单一焦平面，从而优化成像效果，并最大限度减少焦外信号。接下来，为了交联PC水凝胶，使用UVA光源照射含细胞的前体，照射剂量为每毫米厚度每平方厘米3.2焦耳。
或者，可使用成本较低的手持牙科灯。避免对水凝胶过度曝光，因为这会降低细胞活性。物理交联水凝胶则置于37°C条件下。
交联后，取下PDMS水凝胶铸造模具，替换为先前制备的PDMS培养皿。使用无菌刮铲将PDMS压紧在玻璃表面以使其粘附。向PDMS培养皿中带有盖玻片的孔内加入无酚、无血清的培养基或化学成分明确的培养基，以保持水凝胶浸没状态。
将培养皿在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。待含有水凝胶的 PDMS 培养皿固定于显微镜载物台且物镜上已滴加镜油后，使用透射光寻找至少 15 个用于成像的细胞，并通过荧光成像确认转染效果。在显微镜软件中，从视野中心附近的几个细胞中选择，设置 FRET 图像通道的相机参数，并根据文本方案优化每个图像通道的曝光时间和增益。
选择位于水凝胶中心附近、处于相对平坦照明区域内的细胞，其亮度既不宜过亮也不宜过暗，且FRET比值介于0.00至1.0之间。随后，选取多个视野，对至少15个转染细胞进行成像。完成操作后关闭光源，以减少光照暴露。
为配置延时成像的采集速率，请输入采集的时间间隔。基线信号采集应使用较快的速率，例如每个视野每5秒采集一次，而后续的长期信号动力学则采用较慢的速率。选择“立即运行”以开始图像采集，并持续采集5分钟，以在指定视野下建立探针响应的基线。
完成5分钟的图像采集后，加入所需激动剂或拮抗剂，用移液器混匀，并继续成像。根据文本方案完成FRET校准后，在显微镜软件中点击背景感兴趣区域图标的箭头，选择“绘制椭圆形背景感兴趣区域”。在每个视野中靠近细胞的位置绘制并指定一个感兴趣区域（ROI），用于定义背景水平。
确保已选中“保持更新背景偏移”选项，然后单击“背景感兴趣区域”图标，以启用背景感兴趣区域的显示。或者，也可选择“感兴趣区域”图标，并将感兴趣区域属性设置为“用作背景感兴趣区域”，且“每个多点位置的感兴趣区域不同”。使用感兴趣区域背景图标，选择“使用感兴趣区域进行背景扣除”。
在弹出窗口中，在“Subtract Background Region of Interest”选项下选择“Every Image”，在“Apply To”选项下选择“All Frames”。对于每个视野，使用受体发射通道和二值掩膜来定义细胞周围的感兴趣区域时，使用菜单“Binary”中的“Define Threshold”功能，并选择“Apply To Current Frame”。然后，调整下限阈值以选中细胞。
接下来，如有必要，使用二值闭合（Binary Close）功能填充二值掩膜中的孔洞。然后，点击“感兴趣区域”（Region of Interest）图标，选择“将二值图像复制为感兴趣区域”（Copy Binary to Region of Interest），以将二值掩膜保存为感兴趣区域。将后续视野的感兴趣区域追加至已有的感兴趣区域集合中。
删除任何虚假的兴趣区域。然后右键单击兴趣区域，检查其属性是否设置为“用作标准兴趣区域”以及“在每个多点中兴趣区域各不相同”。细胞兴趣区域可手动绘制，但必须注意去除虚假值。
该方案包含了针对超出平面照明区域的细胞以及无平坦视野显微镜的操作步骤。在凝胶化前对水凝胶前体进行离心，可使尽可能多的细胞集中于盖玻片附近的单一焦平面。这有助于最小化背景噪声并提高成像通量。
在此FRET实验中，对于淬灭发射（QE）FRET比率的计算，仅需两张图像即可完成单链二元ICUE1探针的检测，包括激发和发射均为CFP的CFP-CFP信号（即QE），以及激发和发射均为YFP的YFP-YFP受体发射信号。选择多个视野，其中包含位于均匀照明区域内的若干细胞，如图所示。实验开始时，利用受体发射通道的阈值化图像设定背景校正通道信号和细胞分析所用的感兴趣区域（ROIs）。
此外，如图所示，选择表达足够探针的细胞。计算每个像素的量子效率（QE）和敏化发射FRET比率，以及每个细胞的平均FRET比率。计算敏化发射比率的倒数，并对两个比率进行归一化处理。
在佛司可林刺激下，基于 QE 和 SE 的 FRET 比值均检测到软骨细胞内环磷酸腺苷（cyclic AMP）活性的升高。随时间推移，物理交联和化学交联凝胶均显示出 QE FRET 比值的上升，表明环磷酸腺苷信号通路对佛司可林的添加产生了增强的响应。该方法可与其他显微技术（如荧光漂白恢复技术（FRAP）、荧光寿命 FRET（flim FRET）以及 FRET 与各向异性测量）联用，以回答诸如不同微组织类型之间通透性及细胞信号传导差异等问题。
由于在PDMS附近交联反应会被淬灭，因此在设计光交联水凝胶的模具时，务必记住将模具的直径设计得比水凝胶本身略大一些。
概述
本文介绍了一种在三维水凝胶微环境中进行细胞荧光共振能量转移（FRET）成像的方法。该技术可用于细胞内信号传导的实时研究，并可借助常规的倒置荧光显微镜实现。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 发育生物学
- 药理学
背景
- FRET成像是一种研究细胞过程的有力工具。
- 三维水凝胶可以模拟天然组织环境。
- 该方法可实现对多个细胞的高通量分析。
- 传统显微镜技术可用于该方法。
研究目的
- 实现对细胞内信号传导的实时观察。
- 促进用于再生医学的生物材料的开发。
- 改进工程化微组织中的药物筛选流程。
使用的方法
- 制备用于水凝胶浇铸的模具。
- 将培养细胞悬浮于水凝胶溶液中。
- 使用UVA光或牙科灯对水凝胶进行交联。
- 配置显微镜参数以进行FRET成像。
主要结果
- 成功对嵌入水凝胶中的细胞进行成像。
- 优化成像条件以最小化背景噪声。
- 建立FRET分析的基线信号。
- 有效利用感兴趣区域进行背景校正。
结论
- 该方法增强了在三维环境中研究细胞信号传导的能力。
- 它为未来在多个生物学领域的研究提供了框架。
- 在水凝胶中进行FRET成像可推动药物发现的进步。
常见问题
行业重要性概述
在三维水凝胶中进行FRET成像，能够在生理相关的微环境中实时定量细胞内信号传导，直接克服了传统二维检测方法的局限性。该技术可提高早期药物发现的预测可靠性，并为药物筛选和生物材料开发提供机制层面的风险评估支持。该方法与常规宽场显微镜及高通量工作流程兼容，可作为企业级研发管线中可扩展的重要工具。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在三维环境中研究细胞内信号通路，支持功能靶点的验证。
- 通过模拟类组织环境进行假设检验，有助于阐明作用机制并降低研发风险。
- 通过捕捉依赖于微环境的细胞反应，提高预测的可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游化合物筛选工作流程制备经过验证的三维生物系统。
- 通过比率型FRET定量支持检测方法的标准化与可重复性。
- 实现对多种水凝胶类型中多个细胞的高通量成像与分析。
转化与临床前研究
- 将体外信号检测与疾病相关的三维微环境相整合。
- 通过模拟组织特异性响应，实现从发现到临床前验证的连续性研究。
- 揭示材料依赖性的信号差异，支持基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
这种FRET成像方法贯穿从早期发现到先导物识别及临床前研究的全过程，弥合了体外检测与生理相关模型之间的差距。
- Discovery Biology：支持在三维细胞环境中进行假设验证和通路解析。
- Screening：在工程化微组织中提供可重复、定量的读数，用于化合物评估。
- Analytics：提供比率型FRET测量和背景校正后的输出结果，以实现可靠的数据比较。
- Translational Research：实现体外研究结果与类体内组织反应的对接。
- Enterprise Reuse：可适配多种水凝胶系统，并兼容多种显微镜平台。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化成像与分析工作流程，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过早期模拟相关生物学过程，为决策提供依据，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的发现项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备FRET探针设计和定量成像分析的专业知识。
- 需要具备宽场落射荧光显微镜及相容的水凝胶制备工具的使用条件。
- 要求跨团队对成像参数和数据处理流程进行标准化。
- 通过优化实验方案，可适用于不同的水凝胶化学体系和细胞类型。
- 通量和成像深度可能受限于水凝胶的不透明性及显微镜配置。
