F₁F_O ATP酶囊泡制备及线粒体亚微囊泡膜膜片钳记录技术

本实验的总体目标是从大鼠脑组织中分离出F1 F零APAs囊泡，以进行膜片钳记录。该过程首先从大鼠体内取出脑组织并进行匀浆处理；第二步是通过施加压力破坏突触区域。

接下来，将突触体层析到离心管梯度上。最后一步是与毛地黄毒素和L共同孵育，以获得用于膜片钳记录的终末囊泡。线粒体的一个重要功能是通过氧化磷酸化产生ATP。

负责 TP 生成的酶是位于线粒体内膜上的 ATP 合酶。为了深入研究 ATP 合酶的功能，我们分离出一种特殊的亚线粒体囊泡，称为 SMVs。这些囊泡中的 ATP 合酶呈内外翻转的构型。

然后我们使用膜片钳电极记录这些线粒体膜电位（SMVs），并测定其膜的通透性。这可以反映线粒体产生TP的效率。今天演示该实验步骤的是耶鲁大学我实验室的博士后研究员 Sylvia ti。

在此操作中，通过断头法获取大鼠头部后，切开皮肤以暴露颅骨，然后用剪刀或颅骨剪小心地切开颅骨。随后取出脑组织，剔除小脑后将脑组织切碎并进行分离，加入缓冲液，再将其轻柔转移至5毫升玻璃特氟龙匀浆器中，匀浆10次，总时间约5分钟。之后，在台式离心机中以1,500 × g于4°C离心10分钟。

保留含有线粒体和突触体的上清液，弃去沉淀。然后在台式离心机中以16,000 × g、4°C离心10分钟。接着弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL分离缓冲液中，使用细胞破碎装置施加1,200 PSI压力处理10分钟以破坏突触体，随后迅速减压，将破碎后的突触组分分层加样至含有两种不同浓度Ficoll的离心管中，形成两层。

接下来将试管放入SW 50.1转子中，在4°C条件下以126,500 × g离心20分钟。在超速离心机中，沉淀部分为纯化的线粒体，而不同密度的菲亚尔（fial）之间的层为未破裂的突触体。

随后，将沉淀在分离缓冲液中以16,000 × g、4°C条件下在台式离心机中离心10分钟进行洗涤。然后，将线粒体重悬于200微升分离缓冲液中，并加入等体积的1%十二烷基麦芽糖苷（digitonin）。

置于冰上15分钟。接着，加入更多裂解缓冲液，在4°C条件下以16,000 × g离心10分钟。重复此步骤两次，然后将沉淀重悬于200 µL裂解缓冲液中，加入2 µL 10% Lu bra, PX，混匀后置于冰上15分钟。

随后，将混合物与分离缓冲液依次加入离心管中。将离心管置于 SSW 50.1 转子中，在 4°C 条件下以 182,000 ×g 离心 1 小时。离心 1 小时后。

将最终的样品在隔离缓冲液中于4摄氏度下以16,000 × g离心10分钟进行洗涤。典型的电生理装置包括一个放大器、一台配备DigiData 1,440和模拟-数字转换器接口的PC计算机、P-Clamp 10.0软件、显微镜、隔振台以及法拉第笼。首先，使用火焰抛光的微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制出一根移液管。

移液管的最佳电阻应在80至100兆欧之间。将亚线粒体囊泡加入生理细胞内溶液中，然后用相同的溶液填充膜片钳移液管。

在相差显微镜下观察囊泡。在室温下对SMVs进行膜片钳记录后进行显微成像。当膜电位分别维持在从负100毫伏到正100毫伏的电压范围内时，每段时间持续10秒，记录其电活动。

使用放大器电路对记录的数据进行5 kHz滤波，并用Clampfit 10.0软件进行分析。该图显示了由细胞质和线粒体制备的裂解液的印迹结果。上图显示了使用针对细胞质蛋白GAPDH的抗体进行的免疫印迹。

底部图显示了使用针对线粒体内膜蛋白 Cox4 的抗体进行的印迹结果。此处展示了在添加 1 毫摩尔 ATP 前后两个具有代表性的膜片钳记录。钳制电位为 +70 毫伏。虚线代表 0 皮安。

每条迹线记录时长为10秒，迹线之间间隔10秒并依次显示。以下是CMA指示剂在存在SMV以及在无TP和有TP条件下随时间变化的荧光强度变化示例迹线。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何分离线粒体及含有F1FO ATP合酶的亚线粒体囊泡。此外，您还应理解如何在囊泡膜上使用电极形成高阻封接，以分析ATP合酶复合体的通道活性。