利用成对膜片钳记录技术对急性脑切片中神经元微环路的电生理学与形态学特征进行表征

以下实验的总体目标是展示如何从功能和结构两方面对形态学上可识别的神经元之间的突触连接进行表征。该目标通过获取用于研究特定突触连接而优化的急性脑切片来实现，随后采用膜片钳技术检测是否存在突触耦合的神经元。

为此，需对单个前瞻性突触后神经元进行膜片钳记录，然后使用第二根移液管刺激周围神经元，以确定是否存在突触连接。若未观察到反应，则移动刺激电极。一旦发现连接，便以全细胞模式重新匹配突触前神经元。

在对这些神经元进行电生理记录并同时进行生物素填充后，将脑片固定，进行生物素染色处理，并对神经元进行计算机辅助的三维重建。最终，我们的方法旨在实现神经元微环路的结构与功能相关联的定量分析。对突触连接的神经元进行成对记录的主要优势在于，我们能够对神经元微环路中的突触前和突触后神经元进行结构与功能的相关性分析。

最近引入的技术，例如神经元的光刺激，迄今为止尚无法以如此高的细节水平实现这一目标。该方法能够研究形态学上可识别的神经元类型之间的兴奋与抑制相互作用，以及神经活动如何被调控。将由 Guan 演示 pet 记录的实验操作流程。

他是在我实验室做博士后的研究人员。在制备好目标区域的脑片后，将其在此期间孵育，同时拉制膜片钳电极，电极应具有细长的电极杆。将脑片用铂金丝网固定在记录 chamber 中后，用内液填充记录电极。

将移液管放入前置放大器中，使用电阻为8到10兆欧、内液为钠盐替代钾盐的搜索性膜片移液管，以全细胞模式对一个潜在的突触后神经元进行封接。对搜索性移液管施加轻柔的负压，以松散封接模式（attached configuration）封接一个潜在的突触前神经元。

在电流钳模式下，将松散封接状态下的膜电位维持在负30至负60毫伏之间。随后施加0.2至2纳安的大电流脉冲，以诱发潜在突触前细胞的动作电位。在电压反应中观察到该动作电位表现为一个小的尖峰电位。

将刺激频率设置为 0.1 赫兹，以防止突触后反应衰减。如果突触后神经元对被测试的潜在突触前神经元电极刺激无反应，则更换另一个潜在突触前神经元，以松封接模式进行记录。以此方式最多测试 30 个潜在突触前神经元。

只要能够形成电阻大于30兆欧的封接，就继续使用同一根搜索电极。如果在松散封接模式下刺激可在突触后神经元中诱发出潜伏期小于5毫秒的兴奋性突触后电位（EPSP）或抑制性突触后电位（IPSP），则移除用于刺激的搜索电极，并改用记录电极（内充含生物素的常规内液，电阻为4至8兆欧）对突触前神经元进行膜片钳封接，以全细胞电流钳模式进行记录。

通过向突触前神经元注入电流以诱发电动作电位，并记录突触后反应。将数据存储在计算机中，用于后续离线分析。在整个记录过程中，生物素扩散进入神经元，以获得充分的染色。

根据神经元的大小，让生物素扩散至少15至30分钟。对于具有高连接率的神经微环路，不使用搜索电极，而是直接对突触前神经元进行全细胞模式膜片钳记录。

然后使用充满常规内液的膜片电极，对另一个处于全细胞记录模式的潜在突触后神经元进行膜片钳制，两个细胞均应置于电流钳制模式下。在突触前细胞中诱发一个动作电位，并监测相应的突触后神经元是否产生突触后电位。如果该神经元对突触前刺激无反应，则更换新的电极，再次以全细胞模式对另一个新的神经元进行膜片钳制。

当找到细胞后，继续进行记录，方法如前所述，且不更换膜片电极。按照文本方案中所述固定并安装脑片后，在光学显微镜下观察生物素标记的神经元。确保轴突膨大结构和树突棘清晰可见。

使用商用神经元示踪系统，手动追踪神经元或突触连接的神经元对。务必包含即使较小的轴突或树突侧支。利用示踪结果获取三维神经元重建图像，并在示踪软件的相应模块中对神经元重建图像进行三维空间收缩校正。

包埋介质的收缩校正因子在x和y方向上约为1.1，在Z方向上约为2.1。一对相互耦合的细胞，由一个棘状星形细胞和一个快速放电的神经元组成，在第四层皮质中用生物素填充。

记录过程中，绿色圆点表示突触前棘状神经元与突触后中间神经元之间可能的兴奋性突触联系。蓝色圆点表示可能的相互抑制性突触联系。此处展示了突触联系的高倍图像。

绿色空心圆圈表示兴奋性连接，蓝色空心圆圈表示抑制性连接。此处展示的是这对相互连接的细胞的神经 lucid 重建图像。中间神经元的轴突以蓝色显示，其胞体和树突以红色显示。

棘状神经元的轴突显示为绿色，其胞体和树突为白色。插图显示了突触前和突触后神经元的胞体-树突区室。结合推测的突触接触点，在急性脑片的低倍明场显微照片中辨识出了桶状结构的轮廓。

此处展示了一个连接率极低的典型突触连接。六层旁髓细胞中的一个突触前动作电位，在四层星形旁髓神经元中引发了一个单突触兴奋性突触后电位。该跨层连接的潜伏期超过三毫秒，远长于局部同层连接中观察到的大约一毫秒的潜伏期。

以10赫兹频率在第六层旁髓细胞中诱发的两个动作电位，触发了此处所示第四层星形旁髓神经元中的突触后电位。请注意短期易化现象。需要牢记的是，对于特定的突触连接，必须优化刺激条件，并且在记录过程中，实验装置必须保持绝对稳定，才能确保获得最佳的记录效果。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用电生理学测量和形态学重建，全面揭示新皮层神经元微环路的结构与功能特性。