用于检测胚胎发育过程中细胞命运决定的卵裂球外植实验
2013年1月26日
单个胚胎细胞的命运可能受到继承分子和/或邻近细胞信号的影响。利用卵裂期非洲爪蟾胚胎的命运图谱，可以鉴定出单个卵裂球并进行分离培养，以评估继承分子与细胞间相互作用各自的贡献。
本视频展示的方法利用卵裂期 opus 胚胎的命运图谱，通过分离单个囊胚进行培养，以评估胚胎硫酸盐的形成是由内在指令还是外在指令决定。首先收集两细胞期胚胎，其中第一次卵裂沟平分动物极浅色素区域。这些胚胎在培养至16至32细胞阶段时，去除卵黄膜，并将目标细胞周围的邻近细胞解剖分离。例如，解剖得到的囊胚随后被转移至涂有明胶的培养皿中的凹陷处，并进行培养。
当外植体达到所需发育阶段后，可将其收获，利用原位杂交、定量PCR或免疫组织化学方法检测基因或蛋白的表达。该技术相较于其他方法（如培养大量胚胎细胞或器官登录）的主要优势在于，可以通过谱系追踪研究明确其发育命运的单个胚胎细胞，能够在无外源生长因子或邻近细胞存在的情况下进行培养。因此，可直接验证决定该细胞发育为特定组织前体的因素是细胞内在因子，还是需要来自周围细胞的信号。
该方法的可视化演示至关重要，因为布莱尔氏体（Blairs）的解剖及其向培养孔的转移需要在体视显微镜下进行精细操作。在本视频中，我将采用此方法来演示母源性 mRNA 是否会促使细胞偏向神经命运。在解剖显微镜下操作时，使用Illumina研磨膜将四套镊子 sharpen（磨尖）。
准备一对镊子作为备用，以防在操作过程中镊尖受损；将全部四把镊子进行高压灭菌，并存放于无菌容器中。分别配制 500 毫升的 0.1 倍和 1.0 倍改良巴氏生理盐水（MBS），并过滤除菌。将这些溶液置于玻璃螺口瓶中，在 14 至 18 摄氏度下可保存数月。在 100 毫升一倍培养基中配制 2% 电泳级琼脂糖，高压灭菌以溶解琼脂糖；下次使用时，可通过微波加热使琼脂糖液化。
将约 0.5 毫升加入无菌 24 孔培养板每个孔的底部。这可以防止植入物粘附在塑料上。然后将约 2 至 3 毫升加入 2 至 3 个 60 毫米培养皿的底部，轻轻旋转以均匀分布。
这些将用作解剖培养皿，而琼脂糖可防止胚胎粘附在塑料表面。一旦去除胚胎的膜结构，在琼脂糖冷却并凝固后，用火焰灼烧6英寸巴斯德吸管的尖端，直至其熔化成小球状。稍作重塑后，轻轻地将小球接触培养板孔内的琼脂糖表面。
这将形成一个浅的凹陷，用于放置 X explan。对培养板中的每个孔重复此操作。接下来，向培养板的每个孔中加入一毫升 X 无菌培养基。
然后用 0.1 XMBS 填充解剖皿，以利于囊胚分离。解剖皿准备好后，将去除胶膜的受精卵转移至含有 0.5 x 培养基的 100 毫米培养皿中。未立即使用的卵可于 14 °C 培养，同时检查第一个培养皿中的卵是否发育至二细胞期胚胎。
使用解剖显微镜观察第一个培养皿中的胚胎，用塑料移液管将约10个单细胞和双细胞胚胎转移至另一个含有0.5倍培养基的培养皿中。将培养皿置于14摄氏度的培养箱中。该检测方法准确评估细胞发育潜能的能力依赖于根据命运图解剖出正确的胚层组织。
因此，至关重要的是在两细胞期选择具有正确色素分布模式的胚胎，从而确保其符合正常的卵裂模式。如图所示，正常卵裂通常仅发生在胚胎的一侧。
如果供体细胞来源于正常的一侧，这些胚胎仍然可以作为供体使用。当胚胎发育至两细胞期时，将第一次卵裂沟将动物极浅色素区域平分为两部分的胚胎挑选出来，放入另一个培养皿中，并挑选出所需解剖数量约五倍的胚胎。这些胚胎将作为外胚层的供体。
在整个操作过程中，将剩余的两个细胞胚胎与供体胚胎一起放在另一个培养皿中，作为同胞对照，用于确定去卵黄膜胚胎的发育阶段。在胚胎完成分选和解剖后，返回培养箱中的培养皿，寻找更多单细胞和双细胞胚胎。由于单细胞胚胎大约需要90分钟进行一次分裂，因此可在取卵后最多两小时内完成此步骤。
准备外植体时，将五到十个胚胎放入解剖皿中。然后调整第一个胚胎的位置，以便用镊子夹住透明的卵黄膜。该膜通常不可见，但可在动物极处夹住，此处有一清晰的周隙将卵黄膜与胚胎表面分隔开。
用一只手持尖头镊子，夹住待解剖的囊胚远离其表面的一侧，以避免损伤。然后用另一只手持尖头镊子，夹住靠近前一把镊子尖端处的膜，并轻轻向相反方向拉动，以剥离该膜。当膜被去除后，胚胎将变得扁平。
接下来，用镊子夹住一个相邻的细胞，并以此细胞作为操作手柄，避免用另一只手的镊子直接接触待分离的细胞，轻柔地将剩余的邻近细胞从目标细胞周围拉开。如果目标是命运相同的中线细胞，则可成对一起移除。最后，将作为手柄的细胞解剖去除。
用无菌玻璃移液管吸取传代细胞或细胞团，避免产生气泡和过度抽吸。将移液管管尖置于 X 型原代培养皿某孔中培养基液面以下，轻轻排出细胞悬液。细胞应依靠重力滑入浅凹处。
可将来自多个胚胎的细胞团合并到同一个培养皿的同一凹槽中，形成一个单一的外植体。我们将对解剖皿中剩余的胚胎逐一重复此操作。大约处理10个胚胎后，解剖皿中将充满细胞碎片。
当出现这种情况时，更换至下一个解剖培养皿。完成所有解剖操作后，检查外植体是否位于浅凹处。若未就位，可使用经70%乙醇灭菌并晾干的毛环轻轻将其推入凹陷处。在最后一次解剖操作约一小时后，将移植样本置于室温下的实验台中孵育。
使用无菌玻璃巴斯德吸管清除愈合外植体周围的碎片。将外植体置于14至20摄氏度的培养皿中，紧邻含有同胞对照胚胎的培养皿。同胞胚胎将指示该外植体的发育阶段。
培养约一到两小时后，分离的卵裂球将分裂约四次，并脱落来自受损邻近细胞的大部分碎片。20小时后，它们会形成小而坚实的细胞团。当同胞细胞达到所需的发育阶段时，收获外植体。
这些外植体即使部分细胞发生解体，也能保持较好的存活状态。因此，如果培养物中出现浑浊的团块，需使用毛细环或镊子对其进行探查，以确定是否有健康的外植体埋藏其中。用玻璃巴斯德移液管吸取少量培养液将外植体拾取，并轻轻将其排入适合后续检测的固定液或裂解缓冲液中。
在16细胞期解剖两个背侧blasphemers或两个腹侧blasphemers，并在14摄氏度的XMBS中培养，直至其同胞胚胎发育至早期神经板阶段。每个样本均通过原位杂交检测合子神经板基因Sox two的表达情况，其表达产物呈现为蓝色反应信号。
该实验的结果表明，大部分背侧动物极外胚层细胞（神经板前体细胞）能够自主表达 SOX2，即无需胚胎其他区域的额外信号传导。那些未表达 SOX2 的样本可能在解剖时被错误鉴定。
相比之下，腹侧动物极外胚层前体细胞（ventral animal blasphemers）均不表达 SOX2，这些细胞将发育为腹侧表皮。这些数据表明，背侧动物极外胚层前体细胞具有内在形成神经组织的能力，而腹侧动物极外胚层前体细胞则不具备这一能力。部分背侧外胚层细胞还呈现出伸长的形态，提示其正在进行背侧中胚层的形成。
这些卵裂球在完整胚胎中也会逐渐发育形成诺尔（Noor）结构，而通过离体培养的胚胎表达诺尔标记蛋白，可用于检测改变母源性表达的神经基因内源水平所产生的影响。将 Fox D5 的 mRNA 注射到八细胞期的腹侧前体卵裂球中。如图所示，大多数腹侧移植细胞表达了 SOX2。
相反，当通过向八细胞期背侧前体裂球中注射反义吗啉代寡核苷酸以降低内源性 Fox D 五的水平时，仅有少数背侧外胚层组织表达了 SOX 二。这些实验表明，Fox D 五的母源性表达在背侧裂球细胞获得神经命运的内在能力中发挥着作用。在此操作之前，还可采用其他方法，例如向待解剖的裂球中注射 mRNA 以实现功能获得，或注射反义吗啉代寡核苷酸以实现功能缺失，从而回答更多科学问题。
例如，哪些基因参与了细胞产生特定发育命运的内在能力？此外，可以通过向培养基中添加纯化的因子来验证已知的信号分子。该方法还可用于将单个囊胚细胞移植到完整胚胎的新位置。
该实验用于检测移植的细胞是否仍遵循其原有的发育命运，这一信息对于阐明多能性胚胎细胞如何定向分化为特定组织前体细胞的细胞机制至关重要。
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概述
这项研究探讨了遗传分子和细胞间相互作用对裂殖期非洲酋蛙胚胎细胞命运的影响。通过使用命运图谱，研究人员可以单独培养单个胚胎细胞，以辨别内源性和外源性因素的贡献。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 细胞生物学
- 胚胎学
背景
- 胚胎细胞的命运可以受到遗传分子和邻近细胞信号的影响。
- 理解这些影响对发育生物学至关重要。
- 非洲酋蛙胚胎是研究早期发育过程的模型。
- 命运图谱提供了细胞谱系和命运决定的视觉表现。
研究目的
- 评估胚胎细胞的命运是否由内源性因素或外源性信号决定。
- 单独培养单个胚胎细胞以进行详细分析。
- 利用谱系追踪研究来识别发育结果。
使用的方法
- 收集两细胞期非洲酋蛙胚胎。
- 从选择的胚胎细胞中分离邻近的细胞。
- 在受控环境中培养分离的胚胎细胞。
- 使用in situ杂交和QPCR等技术评估基因或蛋白质表达。
主要结果
- 单个胚胎细胞可以在没有邻近细胞影响的情况下被培养。
- 该研究提供了关于细胞命运决定中内源性和外源性因素的见解。
- 基因和蛋白质表达分析揭示了分离细胞的发育潜力。
结论
- 胚胎细胞内的内源性因素在其发育命运中起着重要作用。
- 来自邻近细胞的外源性信号也很重要，但可以单独进行研究。
- 这种方法允许更清晰地理解细胞命运决定机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables direct testing of intrinsic versus extrinsic factors in cell fate determination, providing mechanistic de-risking for target validation in developmental pathways. By isolating single blastomeres with known lineage, it supports predictive confidence in early discovery by clarifying whether cellular responses are cell-autonomous or dependent on microenvironmental cues. This approach aids in distinguishing true target engagement from indirect effects, improving go/no-go decisions in preclinical target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by testing whether a cell’s fate is fixed or influenced by extrinsic signals, informing target autonomy.
- Operational Value: Uses fate maps to identify and isolate single precursors with known developmental potential, enabling precise experimental design.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening readiness by establishing baseline autonomous behavior in a controlled, neighbor-free system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, single-cell resolution readouts (e.g., SOX2 expression via in situ hybridization or qPCR) for pathway-specific reporter assays.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible culture of isolated blastomeres in defined media without exogenous factors, reducing variability.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats, allowing parallel testing of multiple conditions or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links early fate commitment mechanisms to later tissue formation, supporting biomarker-aligned preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes require cell-cell communication, helping de-risk targets dependent on niche signaling.
- Predictive Confidence: Distinguishes cell-autonomous drivers from non-autonomous effects, improving target selection for modulation strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, particularly for pathways where cellular context influences phenotype expression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating variables to determine if a target’s effect is intrinsic or requires intercellular signaling.
- Screening: Produces standardized, quantitative outputs (e.g., marker gene expression) suitable for high-content or multiplexed assay formats.
- Analytics: Enables statistical comparison of fate outcomes across conditions, supporting replication and cross-functional data interpretation.
- Translational Research: Connects early embryonic decisions to later developmental stages, aiding in disease-relevant system modeling when lineage conservation exists.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing genetic or pharmacological perturbations in a defined, isolated cellular context.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating intrinsic cellular properties from extrinsic microenvironmental influences.
- Operational Value: Promotes standardization through defined dissection, culture, and readout procedures, enhancing reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose efficacy depends on cell-autonomous function.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement by clarifying whether a target’s modulation requires combination with microenvironment-modulating agents.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and fluorescence- or marker-guided cell identification using fate maps.
- Dependent on sterile culture infrastructure, including controlled-temperature incubators and precision pipetting tools for blastomere transfer.
- Necessitates standardization of culture conditions (e.g., MBS concentration, temperature) to ensure comparability across experiments.
- Must account for variability in embryo quality and cleavage symmetry when selecting donor cells for isolation.
- Limited to species with well-established fate maps and ex utero culture feasibility (e.g., Xenopus), restricting direct translation to mammalian systems without adaptation.
