一种用于检测胚胎发生过程中功能冗余的反向遗传学方法

本实验的总体目标是确定两个基因在特定细胞谱系特化过程中是否具有功能冗余性。首先，通过将基因特异性的吗啉代寡核苷酸注入发育中的斑马鱼胚胎，分别明确每个基因的缺失功能表型，以此实现上述目的。实验的第二步是建立一种定量分析细胞谱系特化或分化的检测方法。

例如，使用报告基因鱼品系，正如我们在此展示的。该实验步骤的第三步是联合两种形态的 FENO，以同时靶向两个基因的功能缺失。实验步骤的最后一步是评估双基因敲降所引起的表型变化。

最终，通过检测谱系报告基因或分析谱系特异性标记物的表达，可以获得特定谱系细胞功能丧失或获得的结果。该技术相较于现有方法（如小鼠模型中的基因敲除组合）的主要优势在于，仅需在一个实验中联合使用经过验证的吗啉代寡核苷酸，即可在鱼类模型中同时靶向两个甚至三个基因。可在数天内完成对100多个胚胎的显微注射并评估其表型。

该方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如定义控制细胞命运的转录通路。关键调控通路通常由功能冗余的相关基因小家族代表，因此在小鼠基因敲除研究中，由于旁系同源基因的补偿作用，其功能并不明显。

尽管该模型有助于研究斑马鱼胚胎发育，但由于相同的遗传程序在进化过程中通常高度保守，其结果也可应用于小鼠等其他系统。在注射胚胎前，需预先制备显微注射用培养皿。将约12毫升的2%琼脂糖溶于系统水中（即直接取自养鱼系统的洁净水），倒入直径100毫米培养皿的倒置皿盖中。

将两张载玻片以大约45度角插入盖子的两侧。当琼脂凝固后，轻轻将载玻片从盖子上取下，形成用于放置胚胎进行显微注射的凹槽。注射前，将吗啉代（morpholino）储存液以1毫摩尔浓度溶于无菌去离子蒸馏水中，并在室温下保存。在使用前，将吗啉代储存液于65摄氏度孵育5分钟，以确保其完全溶解。

让储备液冷却至室温。每种新设计的吗啉代寡核苷酸（morpholino）都必须通过实验验证其活性及对胚胎的耐受性。在微量离心管中，用去离子蒸馏水对储备液进行一到两倍的系列稀释，得到的工作浓度分别为1 mmol/L、0.5 mmol/L、0.25 mmol/L和0.125 mmol/L。

在解剖显微镜下，使用吸力将已连接至显微操作仪并准确定位的校准注射针进行前端上样。用约一微升最低浓度的吗啉代溶液上样至注射针中。使用移液器将受精的单细胞胚胎转移至显微注射板的槽中。

使用移液器去除培养皿中多余的水分，使胚胎沉入槽底。将注射板置于显微镜下，将针头穿过绒毛膜插入卵黄中。在取出针头并重新定位注射板以接触下一个胚胎之前，完成对每个胚胎的注射。

在学习注射技术时，使用活性染料有助于观察染料注入细胞的过程（如图所示），然后将胚胎转移回含有系统培养水的100毫米培养皿中，在28.5°C条件下进行培养。将针头中残留的吗啉代溶液排出，并用下一个较高浓度的吗啉代溶液填充针头，用于在适当发育阶段对下一批胚胎进行注射。在每个注射的吗啉代浓度下，观察胚胎的表型变化。

每种形态的阈值剂量是指能够产生明确且可靠表型的最低剂量。可能需要进行多轮滴定实验以确定准确的阈值。为检测两个不同基因之间的遗传相互作用。

制备两种目标形态的混合物，每种形态均以其各自的阈值浓度配制。需要注意的是，胚胎可能无法耐受每次注射超过20纳克的总形态剂量。以与之前相同的方式注射胚胎。

在实验组和对照组之间保持注射体积一致，对照组应包括在体视显微镜下单独注射每种吗啉寡核苷酸（morpholino）的样本。注射后立即观察注射胚胎，并在当天内多次监测；使用移液管及时移除任何死亡或濒死的胚胎。因为这些死亡胚胎可能影响其余胚胎的存活率，故可在任意时间使用移液管移走已麻醉或已处死的胚胎。

指向凹面载玻片以供观察。如需拍照，请使用尖头镊子在必要时去除卵壳。

将胚胎稳定在3%甲基纤维素液滴中，筛选出由多种吗啉寡核苷酸组合所产生的特有表型，该表型与单一吗啉寡核苷酸更高外显率的表型有所不同。以下是使用处于阈值浓度的吗啉寡核苷酸注射后的一些野生型胚胎。对于gata5，典型表型为心脏分裂（cardio bifida），即出现两个心脏，原因是心脏前体细胞未能在中线处融合。

注意箭头所示的GFP阳性心肌细胞。六种吗啡的表型包括形态异常的心脏，无法正常环化。这些胚胎也会发育出GFP阳性心肌细胞。

然而，此处显示的胚胎在同时注射 gata five 和 gata six 形态翻译抑制剂后，表现出心肌细胞发育的完全丧失，表明心肌细胞的发育必须表达 gata five 或 gata six 中的至少一个基因。这两个基因在心肌细胞特化过程中具有功能上的冗余性。

在尝试此操作时，首先必须充分验证您的形态学结果，并尽可能确定其确实代表了单个基因靶点的有效敲低。在此操作之后，还可通过其他方法（如结合条件性小鼠无效等位基因）来证明该基因在哺乳动物中的功能同样如此。

观看视频后，您应该能够充分理解如何在胚胎发生过程中确定两个基因是否具有功能冗余性。