使用双光子显微镜定量中国台湾慕尼黑维斯塔大鼠肾小球对荧光大分子的通透性

本实验的总体目标是成功地在体内可视化肾单位的滤过结构，并定量分析荧光大分子在滤过屏障中滤过进入尿液腔的过程。该目标首先通过准备适用于活体动物的显微镜载物台来实现，随后暴露肾脏并将大鼠放置于载物台上。

随后识别并定位单个肾小球，并采集背景三维图像。最后，注入荧光标记的白蛋白，获取单个肾小球的三维体积图像，并定量分析通透性。

最终，可以通过使用管内双光子显微镜获得显示大分子在肾脏肾小球中滤过系数的结果。双光子显微镜的主要优势在于，它能够在活体动物中同时定量肾小球滤过以及近端小管重吸收和转胞吞作用。同时，该技术的意义不仅限于机制研究，还延伸至诊断与治疗领域，因为理解肾小球滤过和近端小管功能的作用至关重要。

白蛋白的重吸收对于确定治疗靶向性至关重要。在麻醉大鼠后，通过颈静脉或股静脉插入留置静脉通路，并剃除左侧腰部从肋骨下方至左大腿上方的毛发。此为非存活性手术。

将大鼠平放在其右侧，使左侧剃毛的一侧朝上。确保大鼠身体平直地置于实验台上，体位伸长，前肢轻轻相互接触，后肢也轻轻相互接触，避免蜷缩。通过触诊感知肾脏位置，以确定其在腹膜后腔的自然位置，并使用记号笔和一对有齿镊子沿身体平行画一条直线。

提起皮肤，用一把止血钳沿画好的线夹住皮肤以压碎组织并防止出血，同时使用一把手术剪沿切口线进行切割。采用相同的步骤切开外层肌肉层，根据需要将其切开至适当厚度。

使用止血钳防止切开内层肌肉时出血，以暴露腹膜。重新触诊肾脏以估计其大小。捏住一条小于肾脏的切口线，确保切口位置刚好位于肾脏上方。

切口宁可偏小，必要时再扩大。找到肾脏后，用镊子夹住其周围的脂肪组织，以交替递进的方式逐步向肾脏下极游离。到达肾脏下极后，轻柔地将肾脏通过切口拉出，同时在肾脏下方轻轻挤压，以协助其顺利外置。

如果切口过小，需压碎肌层并剪开以扩大切口。在暴露大鼠肾脏并将大鼠置于显微镜载物台上进行成像后，重复该操作以暴露肾脏。若显微镜配备可标记位置的电动载物台，使用双通道荧光素棒、阻断滤光片和低倍物镜，寻找并居中单个肾小球，肾小球将呈现为空心的环状结构，周围被近端小管环绕。

由于固有的黄橙色自发荧光标记了每个位置，将物镜转盘切换至高倍水浸物镜，并对每个肾小球采集三维数据集。确保毛细血管袢和鲍曼腔清晰可见。使用伪彩调色板有助于可视化这些结构。

接下来，针对一条表浅的血管缓慢注入荧光标记的白蛋白，并确保给予足够时间，使肾小球滤过系数（GSC）较低的分子在全身充分分布。此步骤的关键在于最大限度地提高血浆中的荧光强度，但需避免达到使显微镜光电探测器饱和的水平，以增强滤过分子的可检测性。等待约10分钟，使可能存在的小分子量片段充分清除后，以1微米为间隔采集三维图像数据，用于后续通过Metamorph图像处理软件计算白蛋白的滤过情况。将含有荧光白蛋白的每个肾小球的三维数据集及其对应的背景图像一并载入分析软件中。

在包曼氏囊边缘与其明确边界之间存在足够空隙的区域，寻找一个表浅的毛细血管袢。在背景体积中，定位到相同的焦平面，该平面应包含含白蛋白图像的所有视觉线索。

在感兴趣的毛细血管袢区域中选择一个区域，并记录平均强度读数。接着，在鲍曼氏腔内选择一个区域，并记录平均强度读数。这些数值将用作定量分析的背景值。

在含有白蛋白的图像中选择肾小囊腔内的相似区域。至少对另外两个区域重复此操作，以获得肾小囊腔内的平均强度值。选择血浆荧光强度最亮的毛细血管袢，并在其周围绘制一个区域。

接下来，使用阈值功能突出显示循环血浆中的高亮度区域，避开其中循环的红细胞形成的暗条纹。记录所选血浆区域的平均荧光强度值。优先选择血浆中较亮的区域非常重要，因为血液中的某些成分会导致血浆荧光水平被低估。

将数值输入 Excel 电子表格以计算 GSC，其中 GSC 等于原始鲍曼腔强度减去背景鲍曼腔强度的差值，除以原始毛细血管袢强度减去背景毛细血管袢强度的差值。滤过的荧光白蛋白的摄取主要发生在近端小管的起始段。

S1段，此图显示了来自慕尼黑维斯塔大鼠的肾小球及S1段的横截面，图像采集于初次注入Texas red RSA团注后约20分钟。图中可见肾小囊腔的开口以及S1段对红色示踪白蛋白的强烈摄取。此图展示了同一数据集的浅层20微米三维投影，此处显示的是注入后约60分钟时拍摄的低倍投影图像。

这些图像表明，活体显微镜可实现对滤过后的输注物质去向的可视化观察，这在一定程度上验证了所观察到的滤过系数。此处展示的图像采集自肾小球表面。该图面板为背景图像，是在输注Texas Red标记的大鼠血清白蛋白约12分钟后拍摄的。这两个图面板采用伪彩绘制。

在鲍曼腔内选取三个小的兴趣区域，用于计算穿过滤过屏障的荧光白蛋白的平均荧光强度。各个区域的平均强度值显示在“显示区域统计”对话框的高亮区域内。该肾小球所得的白蛋白GSC值为0.0111，处于进食状态下慕尼黑星状大鼠品系的典型范围内。

通过该操作流程，可对其他肾结构进行定量和定性分析，以回答更多问题，例如大分子在滤过进入尿腔后最终的转运路径。该技术使肾脏生理学领域的研究人员能够对生理及病理生理动态过程进行多次、纵向的探索。随着时间推移，这一方法得到了持续发展和应用。