在离体血液灌注大鼠肺模型中定量单个微血管通透性

本实验的总体目标是利用基于荧光的方法，定量测定离体大鼠肺脏中单个微血管的通透性。首先分离大鼠肺脏，并用自体血液进行灌注；实验的第二步是在肺部一个小区域插入左心房微导管，用于输注荧光素四号标记的葡聚糖。

然后在注入标记的葡聚糖时，采集肺部微血管的图像。最后一步是使用软件从图像中定量单个微血管的通透性。最终结果可以显示在不同条件下（如LPS处理后）肺微血管通透性的程度。

本实验操作由我实验室的博士后研究员 Dr. Kava Kasami 示范。首先，在确认雄性大鼠已处于外科麻醉水平后，进行气管切开术。使用 PE 90 气管插管，并用缝线固定。接着，使用 21 号蝶形针头向心脏注入 100 至 200 单位的肝素。

等待一分钟，然后放血。收集血液，并与生理盐水一起放置备用。填充两根由三毫米特氟龙管制成的套管，管长四厘米，一端 flare（扩口）。

现在进行开胸手术。在右心室做一切口，切口大小以刚好能插入套管为宜，将一根套管的喇叭形端沿肺动脉方向插入。用缝线固定套管。

采用相同的技术将另一根导管从左心室心尖插入至左心房。用两条宽2毫米的脐带线固定。现在去除阻碍的结缔组织，并将心脏连同导管一起取出。

将它们转移至培养皿中，使肺的膈面朝上，并确保三个套管对齐。将解剖好的标本移至一个可调节的台架上，台架配有18号Tigon导管，该导管连接压力传感器，作为进液和出液管。现在，将收集的血液与等体积的5%白蛋白溶液混合。

将此混合物加入上样储液槽中。以14毫升/分钟的流速启动泵。确保管路中无气泡。

在准备阶段，将肺动脉连接至肺部入口管，将左心房套管连接至出口管。仔细检查管路中无空气，并确认分流阀处于打开状态。

将气管插管连接至第三个压力传感器。通过气管插管以30%氧气充盈肺部。维持肺部压力为5厘米水柱。

现在夹闭分流管，并以每分钟14毫升的流速启动泵。开始灌注肺脏时，在灌注过程中调节泵速，使肺动脉压维持在约10厘米水柱，左心房压维持在3厘米水柱。首先准备输注血液的肺脏。

首先，取一段40厘米长的PE 10导管插入一段30厘米长的PE 90导管中，组装成灌注导管。将PE 10导管的另一端连接至装有1毫升注射器的30号针头上。将连接肺组织的一端导管引至制备装置上方，并将灌注导管连接至该导管末端。

将输注导管引导至左心房，然后进入肺部，直至遇到阻力。用力过大会造成肺组织损伤。微导管的适当切口至关重要，因为微导管对肺部造成的任何损伤都会降低实验方案的成功率。

接下来，用林格液填充注射器，并将其连接至泵。以每分钟 10 µL 的速度缓慢输注溶液。随着时间推移，输注部位将逐渐变得苍白，与肺部其余部分形成对比，除输注部位外，需用塑料快速覆盖以保持肺表面湿润。

接下来为了观察肺部，通过将一个O形环固定在22毫米的盖玻片上来制作一个观察窗。使用旋塞润滑脂将O形环固定在试管架上，然后将该观察窗置于灌注部位上方。

通过将20倍物镜转至盖玻片上方并聚焦于肺组织来完成设置。不应出现视觉畸变。现在用选定的溶液灌注肺组织。

在此示例中，在注入生理盐水后，通过注射泵在60分钟内将1毫升ZI偶联葡聚糖注入肺部。使用成像软件在1小时的灌注过程中每分钟采集一张图像，并在随后的冲洗步骤中继续记录10分钟。在FIT葡聚糖灌注完成后，以相同的流速灌注林格氏液至少10分钟以将其冲洗干净。后续分析所采集的图像时，需在FIT灌注期间对感兴趣区域内的最大荧光强度进行评分。

然后测定10分钟洗脱后残留荧光的最大荧光强度。通过在细菌脂多糖（LPS）处理后输注Fitzy葡聚糖来检测血管通透性的变化，因为这是广泛使用的LI模型。经Ringer's液处理的微血管中，残留的Fitc荧光较低，而经LPS处理的微血管中荧光较高。此外，与Ringer's液输注相比，LPS输注导致通透性指数显著降低，提示在图像视野内所有血管的通透性均出现全局性增加。

此外，与林格氏液灌注相比，LPS灌注导致通透性指数显著降低，提示在图像视野内的所有血管中通透性均出现全局性增加。观看本视频后，您应能充分掌握如何制备离体鸟类肺脏标本、插入左尾微导管以及在微循环水平上测定通透性的方法。