检测神经营养肽ADNF-9在C57BL/6小鼠妊娠期间对抗酒精诱导凋亡作用的实验方法

本实验的目的是在胎儿酒精暴露模型中评估营养性肽类的神经保护作用。首先使实验动物交配，然后对怀孕雌性动物进行营养性肽类处理作为第二步，随后解剖胎儿以分离胎鼠脑组织用于实验。接着将胎鼠脑组织包埋于明胶中进行切片，再进行TUNEL染色以检测细胞死亡结果。

该实验表明，产前酒精暴露会增加神经节隆起区中TUNEL阳性细胞的数量。与对照组相比，给予神经营养肽D和F九后，显著降低了酒精引起的TUNEL阳性细胞增加，效果优于仅接受酒精处理的对照动物。因此，对该方法进行可视化演示至关重要，因为胎鼠脑组织的解剖和包埋步骤较难掌握，胎鼠大脑体积微小，解剖和切片处理均具有挑战性。首先，将约6周龄、体重约20克的雌性C57BL/6小鼠放入雄性小鼠的饲养笼中，每次两小时，于取出后立即开始交配 breeding。

检查每只雌鼠是否存在精栓，以确认已完成交配。若发现精栓，则将此定为胚胎发育第零天（E0），并根据体重将怀孕雌鼠分为四组。其中一组给予酒精液体饮食，可自由获取，并作为其唯一的营养来源。

两组为Perfed对照组，三组为肽处理组，后者应在酒精暴露期间接受腹腔注射DNF九肽。液体饮食。通过30毫升带刻度螺旋盖试管记录动物在24小时内消耗的液体饮食体积，以确定可作为唯一营养来源自由过量提供的每日酒精、液体饮食或配对液体饮食的量。

从胚胎期第7天（E7）至第13天（E13），每天需提供新鲜配制的液体饲料。通过二氧化碳安乐死法处死妊娠第13天（E13）的Myer小鼠，随后进行颈椎脱臼。将尸体仰卧位放置于解剖板上，用70%乙醇清洁腹部。使用无菌剪刀和镊子进行腹部切口。

打开腹腔后，用镊子夹住子宫，并用另一把镊子缓慢轻柔地将蜕膜从子宫上剥离，注意不要刺破胚胎。小心地将胚胎从子宫中取出，并转移至盛有Hank's平衡盐溶液的60毫米×15毫升细胞培养皿中，置于湿冰上。将培养皿和盛冰容器放置在体视显微镜的载物台上，使用超细镊子进行显微解剖。用镊子从胚胎头部顶端剥离皮肤，以暴露颅骨。

在体视显微镜下暴露并清晰观察颅骨后，用镊子夹住脊髓和脑干水平的颅底部位，开始剥离颅骨。从头部后部至前部逐块剥离颅骨。待脑组织完全暴露后，再用镊子将其取出。

然后从原始嗅球或工厂球的基部解剖出胎脑，直至中脑后部。将所有解剖得到的胎脑置于4%多聚甲醛中固定2至3天。若需进行Western blot或酶活性检测，胎脑也可冷冻保存。使用蒸馏水配制10%优级纯明胶溶液后，将剥离式包埋模具填充至一半，静置直至明胶完全凝固。

将对照组和产前处理的胎儿大脑并排置于已凝固的明胶上，以确保对照组与实验组之间的条件一致。确保明胶温度不过高，并在胎儿大脑上方加入液态明胶，形成完整的包埋模具。

最终的模具应类似于此图像所示，将盛有胎脑的制备好的明胶模具置于冰箱中冷藏15分钟。接下来，剥去包埋模具的塑料膜。最终模具应呈现如下图所示的形态，然后将含有胎脑的明胶转移至4%多聚甲醛中固定两天。

第三天，将含有固定胎儿脑组织的明胶块固定在切片机（viome）的载物台上。使用切片机以25至50微米的厚度对脑组织进行冠状切片。将胎儿脑切片收集至磷酸盐缓冲液（PBS）中，然后在水中将切片转移至超粘附载玻片（super frosts plus slides）上，室温干燥15分钟。

15 分钟后，将载玻片放入 PBS 中，留待次日进行 TUNEL 反应检测。首先，在 37 摄氏度下，将载玻片浸入含 20 微克/毫升蛋白酶 K 的 PBS 溶液中，孵育 5 分钟。

然后在轨道摇床上用 PBS 每次 5 分钟，清洗三次。将切片在室温下用含 3% 过氧化氢的甲醇溶液孵育 10 分钟，期间不摇动。随后按前述方法再次洗涤载玻片。

接着，将切片置于冰上，在通透溶液中孵育两分钟。孵育结束后，用 PBS 洗涤两次。与之前相同，使用实验室用纸巾擦干载玻片上切片周围区域。

然后使用画圈笔在载玻片上的切片周围画线。这可以防止染色液外溢，从而允许使用较小的染色液体积。根据制造商说明书配制末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）反应混合液，并将每对切片中的一片与其孵育。

向阴性对照区域加入不含隧道试剂的载体溶液。然后在37摄氏度下孵育载玻片一小时。孵育时间结束后，按照之前的方法，在轨道摇床上用PBS洗涤载玻片三次。

然后用实验室擦拭纸将组织周围的区域擦干。接着，在37摄氏度下，将切片与转换剂POD溶液孵育30分钟，期间不振荡。然后用Tris HCl缓冲液清洗切片三次，每次五分钟。

将切片转移至切片架中，并放入盛有0.05% DAB和0.003%过氧化氢的考林瓶内。用铝箔纸包裹考林瓶，如需要，可在孵育后按前述方法用PBS洗涤，随后将考林瓶置于冰上，在摇床上震荡反应7分钟。根据方案文本部分的详细说明，切片可在进行后续弹道标记复染前保存于PBS中。

以下图像显示了神经营养肽A DNF nine在E13阶段产前酒精暴露后，通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测法在神经节隆起区对抗酒精诱导的细胞凋亡的效果。与PF组相比，A LC组中细胞死亡增加，如箭头所示。在产前酒精暴露的同时给予A D NF nine可减少TUNEL阳性细胞数量。统计分析表明，AD和F nine的给药可防止酒精诱导的TUNEL阳性细胞增加。

数据以均值±均值标准误表示。单个星号表示 P 值小于 0.052。星号表示通过 Newman-Keuls 事后检验，P 值小于 0.01。

每组包含四只动物。因此，在该技术建立后，研究人员及脑发育领域可利用此方法探索药物或化合物对小鼠脑发育的影响。